Orientierung und Analyse der Morphologie von Purpurmembran Monolagen – Wege zur Membranfusion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Erkenntnisse gewonnen, die die Strukturierung von Purpurmembranen auf festen Substraten ermöglichen. Dazu zählen die Erforschung der Morphologie von PM auf unterschiedlichen Substraten, die Orientierung der Membranen und die Fusion von PM zur Gewinnung von ausgedehnten...

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Main Author: Schranz, Michael
Contributors: Hampp, Norbert (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2010
Chemie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Im Rahmen dieser Arbeit wurden Erkenntnisse gewonnen, die die Strukturierung von Purpurmembranen auf festen Substraten ermöglichen. Dazu zählen die Erforschung der Morphologie von PM auf unterschiedlichen Substraten, die Orientierung der Membranen und die Fusion von PM zur Gewinnung von ausgedehnten PM-Monolagen. Die Krümmung der BR-Mutanten D85N und D85T in alkalischen Lösungen wurden mittels AFM und Kraftspektroskopie untersucht. Dabei konnte die Theorie bestätigt werden, nach der die Membrankrümmung auf die Konformationsänderung des BR während des Photozyklus zurückzuführen ist. Durch Kraftspektroskopie wurde die Biegungsrichtung der D85X-Membranen identifiziert und gezeigt, dass die Kräfte, die zur Biegung der Membranen führen größer sind als die Kräfte zwischen PM und Oberfläche. Eine neue Methode zur orientierten Immobilisierung von PM auf einer Oberfläche wurde in dieser Arbeit entwickelt. Die BR-Mutante Q3C wurde auf Goldsubstraten angebunden. Q3C-PM konnte nur mit seiner extrazellulären Seite eine Bindung zur Goldoberfläche eingehen, da der N-Terminus nur von dieser Seite zugänglich war. Die entgegengesetzt liegenden PMs konnten entfernt werden, so dass eine orientierte PM-Monolage erhalten wurde. Durch Einzelmolekül Kraftspektroskopie konnten die Seiten der angebundenen Q3C-PM identifiziert werden. Die Ergebnisse ließen auf einen hohen Grad an Orientierung der PMs schließen. Die an BR-Q3C aufgenommenen Kraftkurven zeigten einen zusätzlichen Peak, der durch die Gold-Cystein-Bindung verursacht wurde. Die Entfaltung der Helix A konnte so erstmals kraftspektroskopisch analysiert werden. Ein weiteres Ergebnis ergab sich aus der Analyse der Kraftkurven: Bei einem Teil der BR-Monomere wurden die α-Helices nicht paarweise entfaltet. Diese Kraftkurven resultierten aus dem Entfalten der Helices A-C in einem simultanen Prozess. Zur Fusion von PM auf Oberflächen wurde der Einfluss verschiedener Substrate auf die Morphologie der PM untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Glimmer große Auswirkungen auf die adsorbierten Biokomponenten hat. Es zeigte sich bei Raumtemperatur und erhöhten Temperaturen eine fortschreitende Denaturierung der PMs von ihren Rändern aus. Diese Denaturierung kann auf Wechselwirkungen mit dem Substrat zurückgeführt werden, da PM in Suspension unter denselben Bedingungen stabil ist. Die Denaturierung konnte mit molekularer Auflösung und zeitaufgelöst beobachtet werden. Durch Modifikation der Glimmeroberfläche mit Polyasparaginsäure konnte die Denaturierung verringert werden. Auch die Substrate Gold und Silicium hatten einen geringeren denaturierenden Effekt. Sowohl der modifizierte Glimmer als auch Gold und Silicium waren nur spärlich mit PM belegt. Die auf die PM wirkenden Kräfte können einerseits zur Denaturierung der Probe führen, sind aber andererseits notwendig, um die PM auf der Oberfläche zu halten. Es zeigte sich, dass nur auf unbehandelten Glimmeroberflächen ein Belegungsgrad mit PM erreicht wurde, der eine Fusion der Purpurmembranen zu einer durchgehenden Monolage ermöglicht. Gebleichte Purpurmembranen wurden auf Glimmer abgeschieden und mit Retinal regeneriert. Diese Vorgehensweise führte zu einer polykristallinen Monolage. Die kristallinen Bereiche wurden durch AFM-Untersuchungen mit molekularer Auflösung abgebildet. Dabei zeigte sich, dass die Bereiche zueinander verdrehte Orientierungen ihrer Kristallstruktur aufwiesen. Zeitaufgelöste Analysen zeigten die Beweglichkeit der Bereiche innerhalb der Membran. Verbesserte Methoden zur Regeneration von PM auf Glimmeroberflächen wurden entwickelt, indem mehrere Faktoren, die auf die Regeneration der Membranen einwirkten untersucht wurden. Es stellte sich heraus, dass das Ethanol, das als Lösungsmittel des Retinals verwendet wurde, einen denaturierenden Effekt auf die Membranen hatte. Die Regeneration ohne Retinalzugabe führte zu kristallinen Bereichen mit einer Ausdehnung von mehreren hundert Nanometern. Durch die verbesserte Regeneration wurde ein Anteil an regenerierten Bereichen von ca. 2/3 der mit PM belegten Fläche erreicht. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse sind für viele Anwendungen von BR relevant, in denen eine Orientierung von PM oder ein Kontakt von PM-Monolagen mit einem Substrat nötig ist. Ein Lösungsansatz für das Problem der Denaturierung von PM wurde durch die Beeinflussung der Oberflächenwechselwirkungen gefunden. Neben der Denaturierung sind jedoch auch der Belegungsgrad und die Desorption der Membranen zu beachten. Generell muss für Schnittstellen zwischen Biomolekülen und herkömmlicher Technik ein geeignetes Substrat gewählt werden, indem alle diese Faktoren berücksichtigt werden. Weitergehende Untersuchungen der komplexen Wechselwirkungen an Oberflächen sind für viele Bereiche der Biotechnologie von Interesse – auch eine weitere Verbesserung der Fusion von PM könnte von den gewonnenen Erkenntnissen profitieren.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2010.0120