Structural Analyses of Borna Disease Virus Nucleoprotein- Phosphoprotein and Nucleoprotein- RNA Interactions

Borna disease virus (BDV) is the only representative of the Bornaviridae in the order Mononegavirales. It is unique among the animal viruses of this order with respect to its transcription and replication in the nucleus, which provides access to the splicing machinery. BDV is noncytolytic, highly ne...

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Main Author: Hock, Miriam
Contributors: Lingelbach, Klaus (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Hygiene u. Med. Mikrobiologie mit Medizinaluntersuchungsamt
Subjects:
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Table of Contents: Borna Disease Virus (BDV) ist ein Vertreter der Bornaviridae in der Ordnung Mononegavirales (MNV). Unter denjenigen Viren dieser Ordnung, die Tiere infizieren, ist es bezüglich seiner Replikation und Transkription im Nukleus, einzigartig. BDV ist nicht zytolytisch, strikt neurotrop und verursacht Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) bei einer großen Anzahl von Vertebraten, insbesondere beim Pferd. Der aktive BDV Polymerase Komplex besteht wie bei allen MNVs, aus dem Nukleoprotein N, dem Phosphoprotein P und der Polymerase L. Bei BDV ist daran außerdem noch das Protein X beteiligt. BVD N bildet Homotetramere und assoziiert nicht, wie im Gegensatz zu Nukleoproteinen anderer MNVs, mit zellulärer RNA. Jedes N Protomer besteht aus zwei helikalen Domänen und kurzen N- und C—terminalen Fortsätzen, mit deren Hilfe das N Tetramer stabilisiert wird. Es war jedoch nicht klar, wie BDV N mit der viralen RNA interagiert, obwohl die starke strukturelle Ähnlichkeit mit den Nukleoproteinen der Rhabdoviren auf vergleichbare RNA Interaktions-Modi hinwiesen. BDV-P spielt durch Interaktionen mit X, N, L und sich selbst eine essentielle Rolle beim Aufbau und der Regulierung des Polymerase-Komplexes, wobei die Oligomerisierung ähnlich wie bei anderen MNVs, für die Bildung eines aktiven Polymerase-Komplexes notwendig ist. P benötigt einen intakten C-terminus zur Interaktion mit dem Nukleoprotein N und kontaktiert möglicherweise zwei unterschiedliche Stellen auf N. Phosphoproteine von Rhabdoviren und Sendai Virus enthalten jeweils zwei unterschiedliche Bindestellen für N. Über die eine wird die Bindung des Nukleoproteins an unspezifische RNA verhindert, über die andere binden die Phosphoproteine an N-RNA Komplexe und vermitteln so die Ausbildung eines aktiven Polymerase Komplexes. Interessanterweise benötigt das Nukleoprotein von BDV das Phosphoprotein nicht, um die Interaktion mit unspezifischer RNA zu verhindern, da das Nukleoprotein spontan Tetramere ausbildet, ohne dabei RNA zu komplexieren, was eine Ausnahme unter den Mononegavirales darstellt. Das Ziel meiner Untersuchungen war es, die Wechselwirkungen zwischen dem Nukleo- und dem Phosphoprotein, und dem Nukleoprotein und der viralen RNA mithilfe von biochemischen, biophysikalischen und strukturaufklärenden Methoden aufzuklären. Obwohl es nicht gelang, röntgenkristallographische Daten, weder von N-P, noch N-RNA Komplexen zu erhalten, konnte gezeigt werden dass P‘, eine N-terminal verkürzte und in BDV infizierten Zellen vorkommende Isoform des Phosphoproteins, zu Tetrameren oligomerisiert. Es interagiert mit N und formt mit diesem Heterooktamere, wobei die letzten 5 C-terminalen Aminosäurereste zur stabilen Komplexbildung benötigt werden. Das tetramerische Nukleoprotein wird in Anwesenheit von BDV genomischer 5’ RNA destabilisiert, was zu N-RNA Polymeren führt. Solche N-RNA Polymere, werden auch in Anwesenheit von P‘ gebildet. Elektronenmikroskopische Analysen der N-RNA und N-P‘-RNA Komplexe zeigen große “offene” Ring- und Stäbchenartige Strukturen. Die RNA innerhalb dieser Strukturen bleibt dabei ungeschützt und zugänglich für RNase. Beim enzymatischen Abbau der RNA bleiben die N oder N-P‘ Polymere jedoch intakt, was die Vermutung zulässt, dass die Polymere nicht alleine durch die RNA stabilisiert werden. Interaktionen zwischen N und der viralen RNA werden durch Erkennung basischer Aminosäurereste im Inneren einer Spalte im Nukleoprotein vermittelt.