RNAi-Untersuchungen und Überexpression von Genen der Rosmarinsäurebiosynthese

Die Rosmarinsäurebiosynthese ist an Zellkulturen von Coleus blumei (Lamiaceae) aufgeklärt worden. Die beteiligten Enzyme sind bekannt und wurden charakterisiert und die meisten entsprechenden Gene kloniert. Unter diesen Enzymen befinden sich die Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) und die Rosmarin...

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Hücherig, Stephanie
Beteiligte: Petersen, Maike (Prof.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2010
Pharmazeutische Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Die Rosmarinsäurebiosynthese ist an Zellkulturen von Coleus blumei (Lamiaceae) aufgeklärt worden. Die beteiligten Enzyme sind bekannt und wurden charakterisiert und die meisten entsprechenden Gene kloniert. Unter diesen Enzymen befinden sich die Hydroxyphenylpyruvat Reduktase (HPPR) und die Rosmarinsäure Synthase (RAS), von denen vermutet wird, dass sie spezifisch für Rosmarinsäurebiosynthese sind. Um dies abzuklären und eventuell regulatorische Mechanismen festzustellen, sollten diese beiden Enzyme durch die Technik der RNAi herunterreguliert und der Effekt auf die Rosmarinsäureakkumulation beobachtet werden. Zusätzlich sollte durch die jeweilige Überexpression der Gene geklärt werden, ob sich der Rosmarinsäuregehalt dadurch steigern lässt. Zur Klonierung der RNAi- bzw. Überexpressionskonstrukte wurde der pHANNIBAL-Vektor in Kombination mit dem binären Vektor pART27 verwendet. Die RNAi- und die Überexpressions-Konstrukte in pART27 wurden durch die Transformation von sterilem Pflanzenmaterial mit Agrobacterium rhizogenes stabil in das Genom von Coleus blumei eingebracht. Die Untersuchungen wurden an den durch die Transformation mit Agrobacterium rhizogenes erhaltenen Hairy Roots in Flüssigkultur durchgeführt. Da verschiedene sterile Pflanzenkulturen und verschiedene Agrobacterium rhizogenes-Stämme zur Verfügung standen, wurde zuerst eine Testtransformation mit verschiedenen Coleus blumei/Agrobacterium rhizogenes-Kombinationen durchgeführt. Dazu wurden Kontroll-Transformationen mit Agrobakterien ohne zusätzliche Plasmid-DNA gemacht und Transformationen mit HPPR-RNAi-Konstrukt transformierten Agrobakterien. Als beste Kombination stellte sich die Pflanzenlinie ColV1 mit dem Agrobacterium rhizogenes-Stamm LBA15834 heraus. Sie lieferte die vitalsten Wurzeln und zeigte einen akzeptablen Rosmarinsäuregehalt von etwa 1,5 % im Trockengewicht der Hairy Roots. Zusätzlich zeigten die daraus gewonnen Hairy Root-Kulturen den deutlichsten RNAi-Effekt. Diese Pflanzen/Agrobakterien-Kombination wurde für die Transformation der Pflanzen mit den HPPR- und RAS-RNAi- und Überexpressionskonstrukten und den entsprechenden Kontrollplasmiden verwendet. Für die Kontrollen wurde Pflanzenmaterial mit Agrobakterien mit Expressionsvektor ohne Fremd-DNA oder ohne Vektor transformiert. Die gewonnenen Hairy Root-Flüssigkulturen wurden molekularbiologisch untersucht und auf die Anwesenheit der Konstrukte, die Abwesenheit von Agrobakterien, die Anwesenheit der Agrobakterien-Gene rolA, rolB und rolC und die mRNA-Gehalte von RAS und HPPR getestet. Zur Bestimmung der Anzahl der Transformationsereignisse wurden Southern Blots durchgeführt. Dazu wurden einmal 35S Promotor des pHANNIBAL und einmal das nptII-Gen des pART27 mit einer entsprechenden Sonde nachgewiesen. Es lagen jeweils mehrere Transformationsereignisse vor. Für diese Untersuchungen wurde der Rosmarinsäuregehalt bestimmt und die Aktivitäten der Enzyme Tyrosin Aminotransferase (TAT), Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL), HPPR und RAS bestimmt. Die Auswirkungen der RNAi und Überexpression machten sich vor allem in den Rosmarinsäuregehalten bemerkbar. Die RNAi-Linien zeigten einen deutlich verringerten Gehalt, die HPPR-Überexpressionslinien einen erhöhten Gehalt. Die Enzymaktivitäten aus Proteinrohextrakte zeigten bei den RNAi-Linien keine Reduktion, bei den Überexpressionslinien hingegen konnte bei HPPR eine deutlich höhere Aktivität gemessen werden. Die RAS-Überexpressionslinien zeigten Cosuppression und verhielten sich ähnlich wie die RAS-RNAi-Linien oder die Kontrollen. Die Hairy Root-Linien wurden auf eine Akkumulation von Zwischenprodukten der Rosmarinsäurebiosynthese hin untersucht, es konnte jedoch nur Kaffeesäure nachgewiesen werden, die jedoch in keinem Bezug zur verminderten oder erhöhten Rosmarinsäureakkumulation stand. L-Tyrosin und L-Phenylalanin sind die Ausgangsverbindungen der Rosmarinsäurebiosynthese. Bei Supplementationsversuchen wurde dem Kulturmedien von Kontroll-Linien ohne Vektor und Überexpressionslinien von HPPR und RAS die Aminosäuren L-Tyrosin und L-Phenylalanin zugesetzt. Die supplementierten Kulturen zeigten jedoch gegenüber den unsupplementierten Kontrollen keine vermehrte Rosmarinsäureakkumulation. Da die HPPR aus Coleus blumei sehr nah mit der Hydroxypyruvat Reduktase (HPR2) aus Arabidopsis thaliana verwandt ist, wurde das bereits in einem Expressionsvektor vorliegende Enzym in Escherichia. coli exprimiert und charakterisiert. Die gewonnen Daten wurden mit den vorhandenen Daten der heterolog exprimierten HPPR und der nativen HPPR aus Coleus blumei verglichen.