Regulation of proto-oncogenic Pim-1 kinase and miR-17-92 microRNAcluster in the human leukemia cell line K562

In this thesis the regulation of the oncogenic kinase Pim-1 and the microRNA cluster miR-17-92 has been investigated using the leukemia cell line K562 as a model system. Pim-1 and miR-17-92 have been reported to be highly expressed in the context of leukemia cells as well as in other cancer cell lin...

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Main Author: Prinz, Robert
Contributors: Hartmann, Roland Karl (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
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Table of Contents: In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Expression der Pim-1 Kinase und der Expression des microRNA clusters miR-17-92 untersucht. Als Modellsystem diente die Leukämie-Zelllinie K562. In dieser Zelllinie ist sowohl die Kinase Pim-1 als auch das microRNA cluster miR-17-92 überexprimiert. Dadurch ergibt sich die Fragestellung ob möglicherweise ein Zusammenhang zwischen diesen beiden Entitäten in der Zelle gegeben ist und ob Pim-1 die Regulation des miR-17-92 clusters steuert. Weiterhin stellt sich die Frage nach der Bedeutung der beiden Spieler für Zellproliferation und Apoptose bzw. Zellzyklus im hier vorliegenden Fall der Überexpression. Ein Wissen um die Targets der vom Cluster produzierten microRNAs (miR-17-5p, miR-3, miR-18, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1, miR-92a-1) ist daher von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle von p21, einem Zellzyklusregulator, untersucht. Mittels LNA-basierten antisense Oligonukleotiden LNA, locked nucleic acid) wurden miR-17 sowie miR-20 in K562 Zellen herunterreguliert bzw. stöchiometrisch blockiert und die Effekte auf p21 evaluiert. Dies geschah durch Transfektion der entsprechenden Moleküle mittels Elektroporation. Es zeigte sich, das p21 in diesem System quasi permanent durch zelluläre microRNAs 17 und 20 runterreguliert wird. Die Gabe von Antisense Molekülen bewirkte eine Derepression von p21 was mit Western Blot Analysen gezeigt wurde. Somit konnte die Regulation des wichtigen Spielers p21 durch das microRNA cluster miR17-92 gezeigt werden. Weiterhin stellt sich die Frage inwieweit Pim-1 bei der Aktivierung der microRNA-Expression vom miR-17-92 cluster eine Rolle spielt. Bioinformatorische Analysen sagen einen Promoter innerhalb des Locus, bzw. unmittelbar vor dem Cluster voraus. Bisher wurde nur die Expression des Clusters aus einem ca. 7 kb umfassenden Transkript des genomischen Locus (Chr13ORF25) belegt. Möglicherweise wird aber das Cluster auch direkt über diesen internen Promoter reguliert. Um dies zu evaluieren wurden Transkriptionsanalysen über den gesamten Locus hinweg durchgeführt. Dies geschah nach Pim-1 knockdown. Dazu wurde RNA präpariert und mittels qRT-PCR für entsprechend relevante Regionen analysiert. Es zeigte sich eine Aktivierung des Clusters 48 Stunden nach Pim-1 knockdown. Ein mechanistischer Zusammenhang konnte nicht gezeigt werden. In unserer Arbeitsgruppe wurde jedoch die Bindung des Heterochromatin Protein 1 gamma in der internen Promoter-Region in Abhängigkeit von Pim-1 mittels Chromatin Immunopräzipitation untersucht. Dabei zeigte sich eine Abhängigkeit der Bindung von HP1gamma von Pim-1. Dies geschah ebenfalls über Knockdown Analysen von Pim-1. Um die Rolle des internen Promoters weiter zu untersuchen wurden Fragmente unterschiedlicher Größe in ein Luciferase Reportersystem kloniert. In diesen Promoter-Aktivitätsassays zeigte sich eine deutliche Aktivität der Region vor dem miR-17-92 cluster. Die Mutagenese zweier putativer non-consensus TATA-Boxen im vorhergesagten Promoter zeigte zudem eine Minderung der Aktivität entsprechender Fragmente um 30 Prozent. Die Rolle als Promoter ist daher naheliegend, ob jedoch eine weitere Pim-1 unabhängige Regulation an diesem internen Promoter von statten geht, bleibt offen. Die Kinase Pim-1 stellt an und für sich schon ein interessantes Ziel dar, da sie in verschiedenen Tumorgeweben überexprimiert wird, wie z.B. Prostatakarzinom und Leukämien. Im Kontext der zellulären microRNA Regulationseben wurde die Fragestellung behandelt, inwiefern Pim-1 über miRNAs beeinflusst wird. Anhand von Datenbankanalysen bzw. Software-Vorhersagen wurde miR-33 ausgewählt und im Kontext der Zelllinie K562 untersucht. Die 3´UTR von Pim-1 wurde dazu in ein Luciferase Vektorsystem kloniert und die Expression analysiert. Bindestellen für miR-33 wurden in entsprechenden Kontrollkonstrukten mutiert. Sogenannte miR-33 Mimics, Moleküle die maturen microRNAs entsprechen, wurden in die Zellen tansfiziert um den Einfluss auf die Reportersysteme zu untersuchen. Es wurde gefunden, dass Pim-1 tatsächlich durch Bindung von miR-33 reguliert wird.