Charakterisierung neuer Interaktionspartner der NFAT-vermittelten Transkription im Pankreaskarzinom

Die nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFATs) wurden vor allem in der Regulierung der Immunantwort charakterisiert, wo sie in der Induktion der Genübertragung als Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle spielen (Rao et al. 1997). In den letzten Jahren wurden NFAT-Proteine nicht nur in...

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Main Author: Malsy, Manuela
Contributors: Ellenrieder, Volker (Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Innere Medizin
Subjects:
Sp1
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFATs) wurden vor allem in der Regulierung der Immunantwort charakterisiert, wo sie in der Induktion der Genübertragung als Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle spielen (Rao et al. 1997). In den letzten Jahren wurden NFAT-Proteine nicht nur in T-Zellen, sondern auch in anderen Zellen außerhalb des Immunsystems beobachtet, wo sie die Expression zentraler Gene der Differenzierung und des Wachstums kontrollieren (Viola et al. 2004). So werden sie u.a. auch in Pankreaskarzinomzellen (Buchholz et al. 2006) exprimiert. NFAT-Proteine sind primär zytoplasmatisch lokalisiert und translozieren erst nach Aktivierung in den Zellkern. Dort interagieren sie mit anderen Bindungspartnern an der DNA (Hogan et al. 2003). Es handelt sich hierbei um Transkriptionsfaktoren, die mit NFAT-Proteinen kooperieren und so die Selektion und Regulierung NFAT-kontrollierter Gene beeinflussen. Die vorliegende Arbeit fokussiert auf NFATc2, welches zwar eine hohe Expressionsintensität im Pankreaskarzinom aufweist, dessen Funktion und DNA-regulierenden Eigenschaften hier jedoch unbekannt sind. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, mögliche Interaktions-partner des Transkriptionsfaktors NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen zu identifizieren und zu kennzeichnen. Zunächst wird in Vorarbeiten die Expression von NFATc2 und potentieller Partnerproteine, die bereits in der Literatur in anderen Zellarten und Geweben beschrieben werden und zusätzlich die Kriterien einer Calcium-abhängigen Regulierung und einer nachgewiesenen onkogenen Wirkung im Organismus erfüllen, in einer Reihe etablierter Pankreaskarzinomzelllinien untersucht und bestätigt. Ebenso wird Ionomycin, ein Stimulans, gewählt, um eine zuverlässige Translokation von NFATc2 in den Zellkern durch Aktivierung des Calcium-Calcineurin-Signalwegs zu garantieren. Nachteil dieses Stimulus ist seine Zelltoxizität, die eine Verwendung für Langzeitexperimente ausschließt. Die Wirkungsweise von Ionomycin wird durch die Immunfluoreszenzstudie, sowie auf Proteinebene durch Western Blot dargelegt. In ersten Interaktionsversuchen mittels Immunpräzipitation zeigt sich eine Bindung von NFATc2 mit dem Transkriptionsfaktor Sp1. Zur Verifizierung und Charakterisierung der hier beschriebenen Interaktion zwischen NFATc2 und Sp1 bezüglich des Zeitintervalls werden weitere Methoden angewandt. In der Immunfluoreszenzstudie ist eine Kolokalisation der onkogenen Transkriptions-faktoren Sp1 und NFATc2 in Pankreaskarzinomzellen unter Ionomycin-stimulation zu erkennen. Weiterführend wird gezeigt, dass die Transkriptions-faktoren im selben Immunkomplex an der NFAT-Targetsequenz GGAAA in direkte Wechselwirkung treten und Sp1 die funktionelle Aktivität seines Bindungspartners an dem NFAT-responsiven Promotorkonstrukt steigert. Diese Interaktion wird durch Ionomycin in der frühen Phase der Stimulation (bis 60 min) begünstigt. Im zweiten Teil der Arbeit wird die physikalische Interaktion von NFATc2 und Sp1 anhand von Sp1-Deletionsmutanten näher charakterisiert. Dabei kann sowohl auf physikalischer Ebene, mittels Immunpräzipitation, als auch auf funktionaler Ebene mittels Luziferase-Assay gezeigt werden, dass der N-Terminus von Sp1 mit dem Transkriptionsfaktor NFATc2 interagiert und beide Faktoren gemeinsam die Funktion ihrer Zielgene regulieren. Mittels Expressionsprofilanalyse werden im dritten Teil dieser Arbeit einige interessante Zielgene von NFATc2 und Sp1, die nach Ionomycinbehandlung differentiell exprimiert werden, identifiziert. Darunter finden sich das Proto-onkogen c-Fos, der Tumornekrosefaktor TNF-alpha sowie das Adhäsions-molekül Integrin-β-3. Wird Sp1 durch siRNA-Technologie gehemmt, findet sich bei c-Fos und TNF-alpha ein abgeschwächter Ionomycineffekt, sodass die DNA-Bindungsaktivität von Sp1-artigen Transkriptionsfaktoren für die NFATc2-vermittelte Regulation dieser Gene von Bedeutung sein muss. Diese Beobachtung wird in unabhängigen Untersuchungen stellvertretend für c-Fos durch qRT-PCR und dessen funktionelle Bedeutung für die Pankreas-karzinomzelle mittels Thymidin-Proliferations-Assay dargelegt. Als Ergebnis kann eine verminderte Zellproliferation, sowohl nach 24 h als auch nach 48 h bei Knockdown von beiden Transkriptionsfaktoren, beobachtet werden. Schlussfolgernd besteht die Vermutung, dass die Bindungspartner NFATc2 und Sp1 im Pankreaskarzinom interagieren und gemeinsam Zielgene, die für das Zellwachstum verantwortlich sind, regulieren. Der Verlust bereits eines Transkriptionsfaktors verhindert die onkogene Komplexbildung und die Expression möglicher zellzyklusregulierender Gene.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0780