Untersuchungen zur Flavonol- und Proanthocyanidinsynthese als Konkurrenzreaktion in der Flavonoidbiosynthese

Sowohl Flavonole als auch PAs sind als Sekundärmetabolite im Pflanzenreich weit verbreitet, und sie kommen vor allem in Gemüse und Obst vor (Pietta et al., 2000). Aufgrund ihrer pharmazeutischen Eigenschaften übernehmen sie wichtige Funktionen in der Pflanze, aber auch im menschlichen Organismus (Ro...

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Main Author: Preuß, Anja
Contributors: Matern, Ulrich (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Pharmazeutische Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Sowohl Flavonole als auch PAs sind als Sekundärmetabolite im Pflanzenreich weit verbreitet, und sie kommen vor allem in Gemüse und Obst vor (Pietta et al., 2000). Aufgrund ihrer pharmazeutischen Eigenschaften übernehmen sie wichtige Funktionen in der Pflanze, aber auch im menschlichen Organismus (Ross et al., 2002; Thompson et al., 1976; Pietta et al., 2002; Bagchi et al., 2000; Middelton et al., 2000; Pagonis et al., 1986; Harborne et al., 2000; Lee et al., 2006). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Flavonolsynthese in A. thaliana, sowie die PA-Synthese in F. x ananassa untersucht. In den Pflanzenextrakten von Arabidopsis Wildtyp (Col-0), FLS1-Mutante (fls1-2m) und ANS/FLS1-Doppelmutante (ldox/fls1-2m) konnten Flavonole nachgewiesen werden. Einerseits bestätigte das die in vivo Beteiligung der ANS an der Flavonolsynthese in A. thaliana. Andererseits erfordert der restliche Flavonolgehalt der Doppelmutante eine weitere FLS-Aktivität. Im Arabidopsis Genom wurden neben FLS1 fünf weitere putative FLS-Gene (FLS2, 3, 4, 5, 6) gefunden (Pelletier et al., 1999; Owens et al., 2008; Stracke et al., 2009), wobei die FLS4 und FLS6 Pseudogene darstellen (Owens et al., 2008; Stracke et al., 2009). Die ANS dagegen liegt als „single copy“ Gen im Arabidopsis Genom vor (Prescott et al., 2002). FLS1, 2, 3 und 5 sowie ANS aus Arabidopsis wurden in S. cerevisiae und E. coli funktionell exprimiert, wobei nur die At_FLS1 und die At_ANS unter Standardbedingungen FLS-Aktivität zeigten (Owens et al., 2008; Preuss et al., 2009). Die Westernblot-Analyse zeigte die immunologische Verwandtschaft der FLSs (Lukačin et al., 2003), und das alle vier FLS-Polypeptide exprimiert werden. Die Sequenzen der vier FLS Proteine und der ANS zeigten, dass At_FLS1, At_FLS3 und At_ANS konservierte Eisen-, 2-Oxoglutarat- und Substratbindungsstellen (Gebhardt et al., 2007; Owens et al., 2008; Preuss et al., 2009) aufweisen. Die Homologiemodelle von At_FLS1 und At_FLS3 sollten die Ergebnisse der Sequenzanalyse untermauern. Dafür wurde die Kristallstruktur von At_ANS-NAR bzw. DHQ-Komplexen herangezogen (Wilmouth et al. 2002). Die Berechnungen wiesen für die At_FLS3 auf eine leichte Verschiebung von 149His hin, das an der Substratbindung beteiligt ist. Diese könnte die Aktivität der At_FLS3 in vitro beeinflussen. Die Biotransformation mit At_FLS3 ergab nur durch eine relativ hohe Menge an Substrat und deutlich längere Inkubationszeiten den Umsatz von Dihydroflavonolen zu Flavonolen. Somit könnte At_FLS3 an der Flavonolbiosynthese in A. thaliana beteiligt sein. Die rekombinanten Proteine FHT, FLS, DFR, LAR, ANS, ANR und FGT aus F. x ananassa konnten in S. cerevisiae und E. coli (FGT) funktionell exprimiert werden. FHT, FLS, DFR, ANS, ANR und FGT können sowohl 4-hydroxylierte Flavonoide als auch 3,4-dihydroxylierte Flavonoide umsetzen. Bevorzugt wurden aber die 4-hydroxylierten Flavonoide, wobei die ANR eher die 3, 4-hydroxylierten Anthocyanidne bevorzugte. Die LAR zeigte nur mit 3,4-hydroxylierten Flavonoide Aktivität. Für die biochemische Charakterisierung der Erdbeerfrüchte standen sechs Sorten (Genotypen) von F. x ananassa aus dem Norden und Süden Italiens mit fünf Wachstumsstadien (G1, G2, W, T, R) zur Verfügung. In allen Sorten und Wachstumsstadien konnten mit Hilfe der Dellus-Aufarbeitung die Enzyme CHS/CHI, FHT, DFR, LAR, ANR, FGT nachgewiesen werden, wobei die ANR-Aktivität nur in den Stadien G1-W beobachtet werden konnte. Die Genexpression korrelierte mit der Enzymaktivität. Dabei wurden verschiedene Muster, bezogen auf die Wachstumsstadien, beobachtet: (1) Zwei-Phasen-Muster: CHS, CHI, FHT, LAR und ANS, wobei der erste Peak (Transkript bzw. spezif. Aktivität) im G1-Stadium und der zweite im T/R-Stadium auftritt. (2) Ein-Phasen-Muster: DFR und FGT zeigten einen Anstieg der Expression und der Aktivität bis zum T/R-Stadium. (3) Ein-Phasen-Muster: bei der F3H, FLS und ANR nimmt die Expression und Aktivität zum R-Stadium hin ab.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0694