ppn:21936771X Pharmazeutische Chemie Untersuchungen zur Zytoprotektion bei der Anwendung von Wundantiseptika mittels Lumineszenzmessung und Durchflusszytometrie Chlorhexidin 2009-11-24 2011-08-10 urn:nbn:de:hebis:04-z2009-06579 Cytotoxizität Antiseptische Agenzien werden in der Wundbehandlung breit eingesetzt. Neben der antimikrobiellen Aktivität ist die Gewebeverträglichkeit eine der Grundvoraussetzungen für die Auswahl eines geeigneten Wirkstoffs. Zu der in vitro Toxizität der einzelnen Stoffe gibt es zahlreiche Untersuchungen, auch die in vivo Toxizität muss im Rahmen einer Zulassung als Arzneimittel durch Tierversuche untersucht werden. Zwischen in vivo und in vitro Werten gibt es erhebliche Differenzen. Antiseptische Arzneistoffe sind in der Regel in vivo deutlich besser verträglich. Die vorliegende Arbeit ging daher anhand eines Zellmodells der Frage nach, worauf diese Diskrepanzen beruhen. Untersucht wurden die gängigen und weit verbreiteten Antiseptika Octenidindihydrochloridlösung in 0,1%iger Konzentration, Chlorhexidin-digluconatlösung in 1,0%iger Konzentration und Lavasept®-Lösung, die den Wirkstoff Polyhexanid enthält, in 0,1%iger und 0,2%iger Konzentration. Alle Konzentrationen sind handelsüblich. Um eine Wunde zu simulieren wurden immortalisierte Keratinozyten (HaCaT-Zellen) verwendet. Außerdem wurden mit Albuminlösung 5%, Humanem Serum und Fötalem Kälberserum Zusätze verwendet, bei denen ein zytoprotektiver Effekt zu erwarten war. Mit den Methoden der ATP-Messung durch Lumineszenz und der Durchflusszytometrie (FACS) wurde die Zytotoxizität der einzelnen Substanzen bei Anwesenheit eines Zytoprotektivums untersucht. Außerdem wurde untersucht, ob ein antimikrobieller Effekt weiterhin vorhanden war. Durch beide Methoden der Zytotoxizitätsuntersuchungen wurde gezeigt, dass es bei Zytoprotektivaanwesenheit Unterschiede in der Zytotoxiziät der verwendeten Substanzen, aber auch Unterschiede zwischen den einzelnen Zytoprotektiva gab. Bei der ATP-Messung der überlebenden HaCaT-Zellen lag die Überlebensrate der Zellen bei Octenidindihydrochloridlösung 0,1% bei allen drei verwendeten Zusätzen und den verschiedenen Einwirkzeiten deutlich höher als bei Chlorhexidindigluconatlösung 1,0%. Die beiden Lavasept®-Konzentrationen, die nur bei Humanem Serum zum Einsatz kamen, waren besser zellverträglich als die beiden anderen Antiseptika. Beim Vergleich der Zytoprotektiva untereinander war der zytoprotektive Effekt des Fötalen Kälberserums am stärksten, gefolgt von Humanem Serum und Albuminlösung 5%. Bei der durchflusszytometrischen Untersuchung waren bei allen Zytoprotektiva die Lavasept®-Konzentrationen und die Octenidindihydrochloridlösung 0,1% sehr gut zellverträglich. Bei Chlorhexidindigluconatlösung 1,0% war der zytoprotektive Effekt sehr viel geringer ausgeprägt. Mit dieser Methode konnte mit allen Zytoprotektiva der gleiche Effekt wie bei der ATP-Messung beobachtet werden: FCS wies den ausgeprägtesten Effekt auf, Albuminlösung 5% erwies sich als am wenigsten zytoprotektiv, Humanes Serum lag in seinem zytoprotektiven Effekt dazwischen. Beide Methoden sind qualitativ, nicht aber quantitativ miteinander vergleichbar, da aufgrund der Messgeräte bei der ATP-Messung nur 1.000 Zellen und bei der Durchflusszytometrie 500.000 Zellen eingesetzt wurden. Ein ausreichender antimikrobieller Effekt bei Anwesenheit von Albumlösung 5%, FCS und Humanem Serum war bei allen eingesetzten Substanzen zu beobachten, wobei dieser bei Chlorhexidindigluconat und Octenidindihydrochlorid deutlich stärker war, als bei den beiden Lavasept®-Konzentrationen. Der gewebeschützende Effekt der eingesetzten Zytoprotektiva korrelierte mit ihrem Proteingehalt. Fötales Kälberserum, dessen Hauptbestandteil BSA (Bovines Serumalbumin) ist, hatte den stärksten zytoprotektiven Effekt, gefolgt von Humanem Serum und Albuminlösung 5% mit dem geringsten Proteingehalt. Der Unterschied in der Zytotoxizität zwischen den einzelnen Antiseptika bei Albuminlösung 5% ließ sich mit elektronenmikroskopischen Bildern belegen. Hier ließen sich bei Lavasept® und Octenidindihydrochlorid große Protein-Antiseptikum-Zusammenlagerungen erkennen, bei Lavasept® sogar eine Komplexierung der Zusammenlagerungen untereinander. Bei Chlorhexidindigluconat waren nur sehr kleine Zusammenlagerungen erkennbar. Somit ließ sich die Hypothese aufstellen, dass bei Erhalt der antimikrobiellen Aktivität der zytoprotektive Effekt der 5% Albuminlösung bei Antiseptikaeinsatz direkt mit der Größe, der Anzahl und der Komplexierung der Zusammenlagerungen untereinander einhergeht. 2009 opus:2500 Wundantiseptikum Researches into cell protection at the application of antiseptic agents via luminescence measurement und fluorescence activated cell sorting Antiseptic agents are often used in wound care. Tissue compatibility is in addition to an antimicrobial effect an important qualification for the choice of an optimal active component. There are several in vitro cytotoxicity tests for many antiseptic agents. For the registration of a pharmaceutical product you have to make animal experiments to test in vivo cytotoxicity. Between in vivo and in vitro tests there are substantial differences. Normally antiseptic agents are in vitro much better compatible for tissue. In this dissertation a cell culture model was used to give some explanation for this differences. The established and common antiseptic agents octenidine dihydrochloride 0,1%, chlorhexidine digluconate 1,0% and polyhexanide-solution concentrated 0,1% and 0,2% were tested. All this concentrations are standard concentrations. To simulate a wound immortalised ceratinocytes (HaCaT-cells) were used. Albumin 5%, human serum and fetal calf serum (FCS) were also used, because of the expectated cytoprotective effect. With the methods of an ATP-assay by luminescence measurement und fluorescence activated cell sorting (FACS) the cytotoxicity of the substances in presence of a cytoprotective addition was tested. It was also tested if there is still an antimicrobial effect. Boths methods of cytotoxicity measurement showed in presence of a cytoprotective addition differences between the different antiseptic agents. With ATP-measurement there was a bigger contingent of surviving cells when using octenidine dihydrochloride 0,1% than with chlorhexidine digluconate 1,0%. This happened at several measuring times and with several cytoprotective additions. Polyhexanide 0,1% and 0,2% were better compatible for the cells than the other substances using human serum as cytoprotective addition. Comparing the cytoprotective additions FCS had the best cytoprotective effect followed by human serum and albumin 5%. With FACS-measurement polyhexanide 0,1% and 0,2% and octenidine dihydrochloride 0,1% showed very good cell compatibility using all cytoprotective additions. With the application of chlorhexidine digluconate 1,0% there was only a small cytoprotctive effect. The comparison of the cytoprotective additions showed the same cytoprotective order as the ATP-method. Because of the different number of the used cells (1.000 at ATP-measurement vs. 500.000 at FACS) it is only possible to compare the results qualitativly. A sufficient antimicrobial effect was showed for all tested antiseptic agents with all cytoprotective agents. The cytoprotective effect correlated with the protein concentration of the addition. Fetal calf serum (FCS) with the chief ingredient BSA (bovine serum albumin) showed the best cytoprotective effect by human serum and albumin 5%. It was possible to give an explanation for the differences between the antiseptic agents by using images of albumin 5% with antiseptic agents in an electron microscope. With polyhexanide and octenidine dihydrochloride big aggregates of protein and antiseptic agent could be seen. Polyhexanide showed complexes of this protein/antiseptic agent aggregates. Chlorhexidine digluconate showed only very small aggregates. It is possible to hypothesise that the cytoprotective effect of albumin 5% under application of antiseptic agents depends on size, number and grade of aggregation and complexation of protein/antiseptic agent aggregates. ths Prof. Dr. Keusgen Michael Keusgen, Michael (Prof. Dr.) https://doi.org/10.17192/z2009.0657 Polihexanid Chlorhexidine 2009-11-10 doctoralThesis Philipps-Universität Marburg Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Cytotoxicity Octenidine Octenidin https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0657/cover.png 97 application/pdf Antiseptikum Kissel, Gernot Kissel Gernot Fachbereich Pharmazie German Medical sciences Medicine Medizin Antiseptic agent Polyhexanide monograph