Investigation of the Phosphorylation of theC-terminal domains of the cardiac MyosinBinding Protein C by the 5-AMP-activatedProtein Kinase

Seit mehr als 35 Jahren kennt man das Myosin-Bindungs-Protein-C (MyBP-C). In dieser Zeit wurden in dem Gen, welches für die kardiale Isoform dieses Proteins kodiert (MYBPC3) mehr als 150 Mutationen gefunden, die zur hypertrophischen Kardiomyopathie (HCM) führen. Damit sind Mutationen in diesem Gen für mehr als ein Drittel aller HCM-Fälle verantwortlich. Es werden für dieses Protein sowohl eine Rolle in der Regulation der Kontraktion, als auch strukturstabilisierende Aufgaben in der Filamentformation postuliert. Trotz all dieser Tatsachen ist die Funktion des MyBP-C, im Vergleich zu den meisten anderen Proteinen des sarkomerischen Apparates, nicht ausreichend verstanden. Zusätzlich zu den direkten Interaktionen zwischen MyBP-C und den sarkomerischen Proteinen Titin, der leichten Meromyosinkette und Aktin, sind Interaktionen mit der cAMP-abhängigen Protein Kinase (PKA), der Ca2+/Calmodulin-abhängigen Protein Kinase II (CaMKII) und der Protein Kinase C (PKC) am N-terminalen Ende des Proteins bekannt. Die Absicht dieser Abeit war es, die C-terminalen Interaktionen des Proteins mit der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) zu untersuchen. Dieses Enzym wurde in den letzten 10 Jahren Gegenstand umfassender Forschungen. Es werden der Kinase die Beteiligung an zahlreichen regulierenden Prozessen in der Zelle zugeschrieben. Ausserdem wurden Mutationen im PRKAG2-Gen, welches für die γ2-Untereinheit der Kinase kodiert, gefunden. Diese zur Hypertrophie des linken Ventrikels führenden Mutationen sind zudem noch mit Reizleitungsabnormalien (z.B.: Wolf-Parkinson White-Syndrom) vergesellschaftet. Die wichtigen Fragestellungen, die es in diesem Zusammenhang, neben anderen, für ein umfassenderes Verständnis zu beantwortengilt, betreffen die Identifikation weiterer kardialer Proteine, die mit dieser Kinase in Interaktion treten. Durch meine Arbeit sollten die Aminosäure oder die Aminosäuren des C-terminalen Endes des kardialen Myosin-Bindungs-Protein-C (cMyBP-C) identifiziert werden, die von der AMPK in vitro phosphoryliert werden können. Eine Interaktion zwischen dem C-terminalen Ende (C8-C10) und der Kinase wurde von Professor David Carling und seinen Mitarbeitern am Imperial College in London mittels Yeast-two-hybrid assay und weiteren biochemischen Untersuchungen postuliert. Die letzt genannten machten die C8-Domäne des cMyBP-C zum wahrscheinlichsten Ziel der Kinase. Aus diesem Grund habe ich bei meinen Arbeiten mit der Untersuchung dieser Domäne begonnen. Nach Optimierung sowohl der Expressions- und Purifikationsmethoden zur Herstellung der rekombinanten Wildtyp Domäne, als auch einer Reihe mutierter C8-Domänen, war es möglich die Hypothese zu widerlegen, dass sich in der C8-Domäne des cMyBP-C eine durch die AMPK phosphorylierbare Aminosäure befindet. Es zeigte sich vielmehr, dass sich in der N-terminalen leader Sequenz des rekombinanten Proteins ein phosphorylierbarer Serinrest befindet, der von dem Vektor pET-28a kodiert wird. Dieses Serin liegt in der Thrombinerkennungssquenz und seine Phosphorylierung verhindert die Abspaltung dieser Sequenz. Des Weiteren wurde in vitro gezeigt, dass ein von der AMPK phosphorylierbares Serin in der C10-Domäne lokalisiert ist, und dies bestätigt die ursprünglich angenommene Interaktion des C-terminalen Fragmentes (C8-C10) mit der Kinase. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die N-terminalen Domänen des Proteins (C0-C2), die die gut charakterisierten Phosphorylierungsstellen der PKA and CaMII enthalten, in vitro kein Substrat für die AMPK sind. Die C-terminale Phosphorylierungsstelle des cMyBP-C könnte zum einen die Formation des Proteins um das Myosinfilament beeinflussen, andererseits wäre auch denkbar, dass durch eine Mutation im PRKAG2 Gen und der daraus resultierenden Änderung des Phosphorylierungsstatusses des MyBP-C, die postulierte Funktion in der Regulation des kardialen Querbrücken-Zyklusses beeinträchtigt wird.