Gerichtete Proteinevolution als Werkzeug zur Generierung funktionell und strukturell neuartiger Proteine

Proteine mit neuartiger oder verbesserter Funktionalität sind in der Industrie und der Grundlagenforschung von großem Interesse. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Verfahren der gerichteten Proteinevolution, das Hefe-2-Hybridsystem und das Phagen-Display, verwendet und auf die Anforderungen f...

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Main Author: Garbe, Daniel
Contributors: Mootz, Henning D. (Professor Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Chemie
Subjects:
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Description
Summary:Proteine mit neuartiger oder verbesserter Funktionalität sind in der Industrie und der Grundlagenforschung von großem Interesse. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Verfahren der gerichteten Proteinevolution, das Hefe-2-Hybridsystem und das Phagen-Display, verwendet und auf die Anforderungen für zwei unterschiedliche Proteine adaptiert. Im ersten Projekt sollte ein neuer Ansatz zur Generierung eines mit organischen Molekülen schaltbaren Proteins entwickelt werden. Die Bindestelle des Effektormoleküls sollte de novo im hydrophoben Kern des Modellproteins, der SH3-Domäne der c-Abl Tyrosinkinase, evolviert werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt die kleine Aminosäure Ala4 des hydrophoben Kerns durch die sterisch anspruchsvollen Aminosäuren Val und Phe ersetzt. Nach Anpassung der Proteinfaltung durch geeignete Mutationen sollten diese Platzhalter nach Rückmutation eine Kavität für das Effektormolekül hinterlassen. Während die Val-Mutation toleriert wurde und biochemisch durch CD-Spektroskopie und in der Ligandenbindung charakterisiert werden konnte, bewirkte die Phe-Mutation offensichtlich eine Entfaltung der SH3-Domäne. Mit dem Hefe-2-Hybridsystem als Selektionsmethode wurde ein Ansatz entwickelt, um durch Proteinevolution kompensierende Mutationen zu identifizieren, die erneut zu einer stabilen Proteinfaltung führen. Es wurden Fusionskonstrukte aus der DNA-Bindedomäne LexA und der B42-Aktivatordomäne mit dem Peptidliganden und der SH3-Domäne hergestellt, sodass eine Interaktion die Transkription der Reportergene LEU2 und lacZ bewirkte. Von der SH3-Domäne wurden auf DNA-Ebene Bibliotheken hergestellt, die entweder durch epPCR oder durch Zufallsmutagenese von fünf Aminosäuren des hydrophoben Kerns (L16, I18, L24, V47 und I52) mittels einer rekursiven PCR gewonnen wurden. Nach der genetischen Selektion erhaltene Hefekolonien wurden als Kandidaten weiter untersucht. Dabei wurde in hohem Maße das Auftreten von falsch Positiven beobachtet, sodass eine Umorganisation des hydrophoben Kerns nicht erreicht werden konnte. Im zweiten Projekt wurde erstmals ein auf Phagen-Display beruhendes Selektionsschema für die Verbesserung von gespaltenen Inteinen entwickelt. Inteine sind interne Proteine, die sich aus einem Vorläuferprotein unter Verknüpfung der flankierenden Polypeptidketten (N- und C-Extein) autokatalytisch entfernen. Diese Reaktion wird als Proteinspleißen bezeichnet. In gespaltenen Inteinen müssen zunächst das N- und das C-terminale Inteinfragment (IntN bzw. IntC) assoziieren. In dieser Arbeit wurde mit dem künstlich an Position 11 sowie Position 104 gespaltenen DnaB-Intein aus Synecchocystis sp. PCC6803 gearbeitet. Mit erstgenanntem System ließe sich in Zukunft auch der Einbau eines organischer Bausteins anstelle der sterisch anspruchsvollen proteinogenen Aminosäure (vergl. Ala4Phe) im ersten Projekt realisieren. Ein IntN(104)-Fusionsprotein wurde mit dem M13-Phagen, der das komplementäre IntC-Fragment präsentierte, inkubiert und die Spleißreaktion durch Immunoblotting nachgewiesen. Anschließend wurde das IntN(104)-Fusionsprotein durch ein N-terminales Streptavidin-bindendes Peptid (SBP) an Streptavidin-Beads immobilisiert. Die aus der Spleißreaktion resultierenden SBP-Phagenpartikel konnten kompetitiv mit Biotin eluiert werden. Mit diesem Protokoll gelang es, aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen den Hybridphagen über fünf Selektionszyklen um den Faktor 1250 anzureichern. Für das an Position 11 gespaltene DnaB-Intein konnte ebenfalls durch Präsentation des IntC(11)-Fusionsproteins auf der Phagenoberfläche und Inkubation mit einem synthetischen IntN(11)-Fusionspeptid die Modifikation des Phagenproteins durch Protein-Spleißen gezeigt werden. Dabei wurde Desthiobiotin als N-terminale Peptidmodifikation übertragen, wodurch die Phagen an Streptavidin-Beads gebunden werden konnten. So konnte ein Protokoll etabliert werden, das in fünf Zyklen die Anreicherung des Hybridphagen aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen um den durchschnittlichen Faktor 290 gestattete. Schließlich wurde der Einfluss der Aminosäure an Position +2 des C-Exteins auf die Aktivität des an Position 104 gespaltenen DnaB-Inteins anhand von gereinigten Proteinen untersucht. Hierzu wurde mit einem degenerierten Oligonukleotid an jener Position eine sättigende Mutagenese durchgeführt. Neben der natürlich vorkommenden Aminosäure Ile zeigte von den untersuchten Aminosäuren vor allem Ala einen positiven Einfluss auf die Bildung des Spleißproduktes in einer in vitro Spleißreaktion, während z. B. Pro einen inhibierenden Effekt hatten.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0159