Insights into RNase P RNA structure and function by a retro-evolution approach
Li, Dan
RNase P catalyzes tRNA 5’-end maturation in all organisms and organelles. The enzyme is composed of a single RNA subunit plus a number of proteins that increases from bacteria (one protein) over archaea (at least four proteins) to eukarya (nine to ten proteins). Conserved base identities indicate that the RNase P RNA subunits (P RNAs) from all three kingsdoms of life stem from a common ancestor. Yet, only in bacteria the P RNA alone is substantially active in vitro without the protein, whereas archaeal and eukaryal P RNAs are more dependent on the contribution of their protein moieties and display only residual activity when these are absent. RNase P thus represents a natural model system for the switch from ribozyme to ribonucleoprotein enzyme, generally accepted to have occurred during natural evolution of the RNA world to the protein world.
The RNA subunit of cyanelle RNase P from Cyanophora paradoxa contains essentially all structural elements of bacterial P RNAs, but has been reported to be catalytically inactive. In contrast to these previous observations, we were able to detect activity of this P RNA in the absence of protein cofactors. Furthermore, the C. paradoxa P RNA forms a functional holoenzyme with proteobacterial P proteins. Analysis of C- and S-domain swaps between cyanelle and Escherichia coli P RNA revealed that their domains have the capacity to cooperate, because the hybrid RNAs were functional. However, activities of the chimeras lagged behind the catalytic performance of the bacterial P RNA, suggesting that both the C- and S-domain of the cyanelle P RNA are weakly functional, thus limiting the activity of each type of chimera (EC or CE). In addition or alternatively, domain interaction and overall folding may be suboptimal in the chimeras, as it likely is in the wild-type cyanelle P RNA. Furthermore, the organellar ribozyme is unusual compared to the consensus of bacterial P RNAs: RNA-alone activity is low and structural alterations as small as point mutations or switches in Watson-Crick base pair identity at positions that are not part of the universally conserved catalytic core abrogate activity as does incorporating the E. coli L15-16 loop and adjacent regions. These findings indicate that the A,U-rich cyanelle RNase P RNA is globally optimized but conformationally unstable, thus representing an RNase P type of its own rather than simply being a slightly degenerate form of bacterial RNase P. In this context the E. coli P protein nevertheless emerged as a universal player in P RNA activation, and it will be all the more interesting to see if bacterial P proteins are related to any of the P protein components specific to the C. paradoxa cyanelle that yet await identification.
The increased protein proportion of archaeal and eukaryal RNase P holoenzymes parallels a vast decrease in the catalytic activity of their RNA subunits (P RNAs) alone. We show that a few mutations toward the bacterial P RNA consensus substantially activate the C-domain of archaeal P RNA from M. thermoautotrophicus, in the absence and presence of the bacterial RNase P protein. Large increases in ribozyme activity required the cooperative effect of at least two structural alterations. The P1 helix of P RNA from M. thermoautotrophicus was found to be extended, which increases ribozyme activity (ca 200-fold) and stabilizes the tertiary structure. Activity increases of mutated archaeal C-domain variants were more pronounced in the context of chimeric P RNAs carrying the bacterial S-domain of Escherichia coli instead of the archaeal S-domain. This could be explained by the loss of the archaeal S-domain’s capacity to support tight and productive substrate binding in the absence of protein cofactors. Our results demonstrate that the catalytic capacity of archaeal P RNAs is close to that of their bacterial counterparts, but is masked by minor changes in the C-domain and, particularly, by poor function of the archaeal S-domain in the absence of archaeal protein cofactors.
The eukaryal RNase P RNAs from human (H1 RNA) and the lower eukarya Giardia lamblia were recently found to have residual catalytic activity. Nevertheless, the highest activities measured for these eukaryotic P RNAs are more than five orders of magnitude lower than those obtained with bacterial P RNAs. To investigate the structure and function of H1 RNA, we analyzed if the RNA-lone activity of H1 RNA could be improved by approaches that have proven successful in the activation of M. thermoautotrophicus archaeal RNase P RNA. A few H1 RNA variants, HE chimeras and H1 RNA-substrate conjugates were constructed and analyzed. H1 RNA 5, only containing mutations P4/J4/19, is the sole variant with locally confined mutations that showed increased activity. The mutations P4/J4/19 were introduced to restore a bacterial-like P4 known to be a crucial for catalytic activity. The additionally introduced back-to-bacteria mutations P5/P15 further improved catalytic activity slightly, possibly by rigidifying the core structure and/or improving substrate binding. Furthermore, the S-domain of E. coli is unable to productively cooperate with the H1 RNA C-domain, as the chimeric P RNA HE was found to be inactive. Tethering the substrate to H1 RNA, designed to mitigate weak substrate affinity, even reduced H1 RNA activity to non-detectable levels. The kinetic data together with our structural probing and UV melting (not shown) data suggest that H1 RNA has an extremely degenerated, globally unstable structure that is strictly dependent on its natural protein cofactors.
Philipps-Universität Marburg
Natural sciences + mathematics
https://doi.org/10.17192/z2009.0124
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-01248
opus:2362
2009-06-30
Non-coding RNA
Structure
English
Fachbereich Pharmazie
RNase P catalyzes tRNA 5’-end maturation in all organisms and organelles. The enzyme is composed of a single RNA subunit plus a number of proteins that increases from bacteria (one protein) over archaea (at least four proteins) to eukarya (nine to ten proteins). Conserved base identities indicate that the RNase P RNA subunits (P RNAs) from all three kingsdoms of life stem from a common ancestor. Yet, only in bacteria the P RNA alone is substantially active in vitro without the protein, whereas archaeal and eukaryal P RNAs are more dependent on the contribution of their protein moieties and display only residual activity when these are absent. RNase P thus represents a natural model system for the switch from ribozyme to ribonucleoprotein enzyme, generally accepted to have occurred during natural evolution of the RNA world to the protein world.
The RNA subunit of cyanelle RNase P from Cyanophora paradoxa contains essentially all structural elements of bacterial P RNAs, but has been reported to be catalytically inactive. In contrast to these previous observations, we were able to detect activity of this P RNA in the absence of protein cofactors. Furthermore, the C. paradoxa P RNA forms a functional holoenzyme with proteobacterial P proteins. Analysis of C- and S-domain swaps between cyanelle and Escherichia coli P RNA revealed that their domains have the capacity to cooperate, because the hybrid RNAs were functional. However, activities of the chimeras lagged behind the catalytic performance of the bacterial P RNA, suggesting that both the C- and S-domain of the cyanelle P RNA are weakly functional, thus limiting the activity of each type of chimera (EC or CE). In addition or alternatively, domain interaction and overall folding may be suboptimal in the chimeras, as it likely is in the wild-type cyanelle P RNA. Furthermore, the organellar ribozyme is unusual compared to the consensus of bacterial P RNAs: RNA-alone activity is low and structural alterations as small as point mutations or switches in Watson-Crick base pair identity at positions that are not part of the universally conserved catalytic core abrogate activity as does incorporating the E. coli L15-16 loop and adjacent regions. These findings indicate that the A,U-rich cyanelle RNase P RNA is globally optimized but conformationally unstable, thus representing an RNase P type of its own rather than simply being a slightly degenerate form of bacterial RNase P. In this context the E. coli P protein nevertheless emerged as a universal player in P RNA activation, and it will be all the more interesting to see if bacterial P proteins are related to any of the P protein components specific to the C. paradoxa cyanelle that yet await identification.
The increased protein proportion of archaeal and eukaryal RNase P holoenzymes parallels a vast decrease in the catalytic activity of their RNA subunits (P RNAs) alone. We show that a few mutations toward the bacterial P RNA consensus substantially activate the C-domain of archaeal P RNA from M. thermoautotrophicus, in the absence and presence of the bacterial RNase P protein. Large increases in ribozyme activity required the cooperative effect of at least two structural alterations. The P1 helix of P RNA from M. thermoautotrophicus was found to be extended, which increases ribozyme activity (ca 200-fold) and stabilizes the tertiary structure. Activity increases of mutated archaeal C-domain variants were more pronounced in the context of chimeric P RNAs carrying the bacterial S-domain of Escherichia coli instead of the archaeal S-domain. This could be explained by the loss of the archaeal S-domain’s capacity to support tight and productive substrate binding in the absence of protein cofactors. Our results demonstrate that the catalytic capacity of archaeal P RNAs is close to that of their bacterial counterparts, but is masked by minor changes in the C-domain and, particularly, by poor function of the archaeal S-domain in the absence of archaeal protein cofactors.
The eukaryal RNase P RNAs from human (H1 RNA) and the lower eukarya Giardia lamblia were recently found to have residual catalytic activity. Nevertheless, the highest activities measured for these eukaryotic P RNAs are more than five orders of magnitude lower than those obtained with bacterial P RNAs. To investigate the structure and function of H1 RNA, we analyzed if the RNA-lone activity of H1 RNA could be improved by approaches that have proven successful in the activation of M. thermoautotrophicus archaeal RNase P RNA. A few H1 RNA variants, HE chimeras and H1 RNA-substrate conjugates were constructed and analyzed. H1 RNA 5, only containing mutations P4/J4/19, is the sole variant with locally confined mutations that showed increased activity. The mutations P4/J4/19 were introduced to restore a bacterial-like P4 known to be a crucial for catalytic activity. The additionally introduced back-to-bacteria mutations P5/P15 further improved catalytic activity slightly, possibly by rigidifying the core structure and/or improving substrate binding. Furthermore, the S-domain of E. coli is unable to productively cooperate with the H1 RNA C-domain, as the chimeric P RNA HE was found to be inactive. Tethering the substrate to H1 RNA, designed to mitigate weak substrate affinity, even reduced H1 RNA activity to non-detectable levels. The kinetic data together with our structural probing and UV melting (not shown) data suggest that H1 RNA has an extremely degenerated, globally unstable structure that is strictly dependent on its natural protein cofactors.
Li, Dan
Li
Dan
https://doi.org/10.17192/z2009.0124
Struktur
urn:nbn:de:hebis:04-z2009-01248
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0124/cover.png
RNase P RNA
Philipps-Universität Marburg
Einblicke in die RNase P RNA Struktur und Funktion durch Retro-Evolution
2011-08-10
2009
Insights into RNase P RNA structure and function by a retro-evolution approach
opus:2362
Funktion
Natural sciences + mathematics
Naturwissenschaften
monograph
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Pharmazeutische Chemie
Function
ppn:213671751
doctoralThesis
RNase P katalysiert die Reifung des 5’-Endes von tRNAs in allen Organismen und Organellen. Das Enzym besteht aus einer singulären RNA-Untereinheit kombiniert mit Proteinen, deren Anzahl von Bakterien (ein Protein) über Archaea (mindestens vier Proteine) zu Eukarya (neun bis zehn Proteine) hin zunimmt. Die Konserviertheit einiger Basenidentitäten deutet darauf hin, daß die RNA-Untereinheiten (P RNAs) aller drei Reiche des Lebens von einem gemeinsamen Vorläufer abstammen. Dennoch ist einzig in Bakterien die RNA-Untereinheit in vitro in Abwesenheit des Proteins nennenswert aktiv, während archaeale und eukaryontische P RNAs weit mehr auf die Beteiligung ihrer Proteinuntereinheiten angewiesen sind und bei deren Fehlen lediglich äußerst geringe katalytische Aktivität zeigen. RNase P stellt daher ein natürliches Modellsystem für den Übergang von Ribozymen zu Ribonukleoproteinenzymen dar – eine Entwicklung, von der angenommen wird, dass sie allgemein im Verlauf der Evolution von der RNA-Welt hin zur Protein-Welt stattgefunden hat.
Die RNA-Untereinheit der Cyanelle von Cyanophora paradoxa enthält im wesentlichen alle Strukturelemente bakterieller P RNAs, wurde aber als katalytisch inaktiv beschrieben. Im Gegensatz zu den vorangegangenen Untersuchungen konnten wir katalytische Aktivität dieser P RNA auch in Abwesenheit von Protein-Kofaktoren zeigen. Darüber hinaus bildet die P RNA von Cyanophora paradoxa mit proteobakteriellen Proteinen ein funktionelles Holoenzym. Auch Hybrid-RNAs, bei denen die C- und S-Domäne der Cyanellen-P RNA und der P RNA aus Escherichia coli untereinander ausgetauscht worden waren, waren funktionell, was deutlich macht, dass die Domänen die Fähigkeit besitzen, miteinander zu kooperieren. Die Aktivitäten dieser Chimären lagen jedoch weit hinter denen bakterieller P RNAs zurück, woraus sich schließen lässt, dass sowohl die C- als auch die S-Domäne der Cyanellen-P RNA wenig funktionell sind und somit auch die Aktivität der beiden Typen von Chimäre (EC und CE) limitieren. Zusätzlich oder alternativ könnte auch die Interaktion der Domänen oder die Faltung des Gesamtmoleküls in der Chimäre suboptimal sein, so wie es wahrscheinlich auch für die Cyanellen-Wildtyp-P RNA der Fall ist. Darüber hinaus ist das Organellen-Ribozym ungewöhnlich im Vergleich mit dem bakteriellen Konsensus: Die RNA-allein-Aktivität ist gering, und kleine Strukturveränderungen von nur einer einzigen Punktmutation oder Austausch eines Watson-Crick-Basenpaares an einer Position, die nicht Teil der universell konservierten katalytischen Kernstruktur ist, genügen ebenso, diese Aktivität komplett zu zerstören, wie der Einbau der L15-16-Schleife aus E. coli mit ihren angrenzenden Bereichen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die A,U-reiche Cyanellen-P RNA global optimiert, aber in ihrer Konformation instabil ist. Sie repräsentiert daher eher einen eigenen Typus von RNase P als eine degenerierte Form der bakteriellen RNase P. In diesem Zusammenhang erwies sich das E. coli P-Protein nichtsdestotrotz als universeller Aktivator der P RNA, und die Frage, ob bakterielle P Proteine mit den noch zu entdeckenden spezifischen P-Protein-Komponenten der Cyanelle von C. paradoxa verwandt sind, wird damit noch interessanter.
Der höhere Proteinanteil archaealer und eukaryontischer RNase P-Holoenzyme geht mit einer erheblichen Verminderung der katalytischen Aktivität ihrer RNA-Untereinheiten (P RNAs) allein einher. Wir konnten zeigen, dass wenige Mutationen hin zum bakteriellen P RNA-Konsensus eine wesentliche Aktivierung der archaealen P RNA von M. thermoautotrophicus zur Folge haben, sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart des bakteriellen RNase P-Proteins. Für eine substanzielle Zunahme an Ribozymaktivität war der kooperative Effekt von mindestens zwei strukturellen Änderungen erforderlich. Es stellte sich heraus, daß die P1-Helix der P RNA von M. thermoautotrophicus natürlicherweise verlängert ist, was eine Zunahme der Ribozymaktivität auf etwa das zweihundertfache sowie eine Stabilisierung der Tertiärstruktur zur Folge hatte. Die Aktivitätszunahmen der mutierten archaealen C-Domänen-Varianten waren im Kontext chimärer P RNAs, also in Kombination mit der bakteriellen S-Domäne aus Escherichia coli statt der archaealen, wesentlich ausgeprägter. Dies lässt sich dadurch erklären, dass in Abwesenheit von Protein-Kofaktoren die archaeale S-Domäne ihre Fähigkeit zu fester und produktiver Bindung des Substrats verliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das katalytische Potenzial archaealer P RNAs dem bakterieller P RNAs sehr ähnlich ist, aber durch geringe Veränderungen in der C-Domäne und, vor allem, durch eine geringe Funktionsfähigkeit der archaealen S-Domäne in Abwesenheit archaealer Protein-Kofaktoren maskiert wird.
Für die eukaryontische humane RNase P RNA (H1 RNA) sowie die P RNA des niederen Eukaryonten Giardia lamblia wurde kürzlich eine katalytische Restaktivität entdeckt. Dennoch liegt die höchste für diese eukaryontischen P RNAs gemessene Aktivität mehr als fünf Größenordnungen unter der bakterieller P RNAs. Um die Struktur und Funktion der H1 RNA zu analysieren, haben wir versucht, die RNA-allein-Aktivität der H1 RNA durch die gleichen experimentellen Ansätze zu steigern, die sich bei der Aktivierung der archaealen RNase P RNA aus M. thermoautotrophicus als so erfolgreich erwiesen hatten. Es wurden einige Varianten der H1 RNA sowie HE-Chimären und H1 RNA-Substrat-Konjugate hergestellt und getestet. H1 RNA 5, die lediglich die Mutationen P4/J4/19 enthält, ist die einzige Variante mit lokal begrenzten Mutationen, die erhöhte Aktivität zeigte. Die Mutationen P4/J4/19 wurden dabei eingeführt, um eine Bakterien-ähnliche P4-Helix, mit bekannter entscheidender Bedeutung für die katalytische Aktivität, wiederherzustellen. Die zusätzlich eingefügten Mutationen hin zum bakteriellen Konsensus, P5/P15, steigerten die katalytische Aktivität noch etwas weiter – möglicherweise durch eine Stabilisierung der Kernstruktur und/oder eine Verbesserung der Substratbindung. Die Chimären-P RNA HE erwies sich als inaktiv, was darauf hinweist, dass die C-Domäne der H1 RNA nicht in der Lage ist, mit der S-Domäne von E. coli einen funktionellen Komplex zu bilden. Ein kovalentes Anhängen des Substrats an die H1 RNA, das dazu dienen sollte, die Auswirkung geringer Substrataffinitäten abzuschwächen, führte sogar zu einem Aktivitättverlust unter die Nachweisgrenze. Die kinetischen Daten zusammen mit Strukturuntersuchungen durch nicht-enzymatische Spaltung sowie UV-Schmelzkurven (nicht gezeigt) lassen vermuten, dass die H1 RNA eine extrem degenerierte, global instabile Struktur aufweist, die in ihrer Funktion strikt von den natürlichen Protein-Kofaktoren abhängig ist.
RNase P RNA
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ths
Prof. Dr.
Hartmann
Roland
Hartmann, Roland (Prof. Dr.)
2009-04-29
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