197 application/pdf Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase [4-], Radikalreaktion Gammaaminobuttersäure Enzym-Mechanismus Substrate stereochemistry and examinations on the mechanism of the 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase from Clostridium aminobutyricum urn:nbn:de:hebis:04-z2009-01092 ths Prof. Dr. Buckel Wolfgang Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.) [4Fe-4S]-Cluster Philipps-Universität Marburg Life sciences Biowissenschaften, Biologie 2011-08-10 https://doi.org/10.17192/z2009.0109 On the enzymatic mechanism of 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase and 4-hydroxybutyrate CoA-transferase from Clostridium aminobutyricum Eisen-Schwefel-Proteide Ketyle Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von 4 Aminobutyrat zu Acetat, Ammoniak und Butyrat in Clostridium aminobutyricum. Darüber hinaus wurde die Dehydratase im 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat Zyklus in Metallosphaera sedula als Bindeglied des bisher unentdeckten fünften CO2-Fixierungsweges nachgewiesen. Dieses außer Clostridien nun auch in Archaeen entdeckte Enzym ist ein Homotetramer, in dem jede der 56 kDa Untereinheiten einen [4Fe-4S]-Cluster und einen FAD-Kofaktor enthält. Es katalysiert die ungewöhnlich reversible Dehydratisierung von 4-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA, die die Abstraktion des nicht aktivierten -Protons (pK ca. 40) von 4-Hydroxybutyryl-CoA erfordert. Der postulierte Mechanismus über ein Enoxyradikalintermediat, das zusammen mit Wasserstoffbrückenbindungen zum Thioestercarbonyl den pK auf 8 absenkt, wurde in EPR-Studien untersucht. Es wurde substratinduziert bisher eindeutig nur das Flavinsemichinonradikal sowie möglicherweise ein [4Fe-4S]+-Cluster-Signal, jedoch kein Substratradikal nachgewiesen. Die Aufklärung der Kristallstruktur offenbarte große strukturelle Ähnlichkeiten zu den Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenasen. Obwohl bisher kein Kokristall mit Substrat vorliegt, kann daraus ein Substratbindemodell abgeleitet werden. Wie aus der Kristallstruktur hervorgeht, sind die für die Katalyse in Frage kommenden Aminosäurereste His292, Glu455 und Glu257 sowie der FAD-Kofaktor und der [4Fe-4S]-Cluster im hypothetischen aktiven Zentrum lokalisiert. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Substratstereochemie und Untersuchung der Interaktion mit den Kofaktoren zur Bestätigung des Bindemodells. Dafür wurden stereoselektiv isotopenmarkierte 4-Hydroxy[2-2H1]butyryl-CoA-Ester ausgehend von 3 Benzyloxypropan-1-ol über chirale Reduktion mit ALPINE-BORANETM und anschließender Kettenverlängerung synthetisiert. Untersuchungen der Reaktionsprodukte mit MALDI-TOF-MS zeigten eine Abstraktion des 2Re-Protons. Zusammen mit der zuvor festgestellten Abstraktion des 3Si-Protons kann nun für die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratayse und die Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase dieselbe Stereoselektivität bestätigt werden. Die ungewöhnliche Koordinierung mit His292 zeigt, dass das Fe1 des Clusters als Lewis-Säure bei der Abstraktion der Hydroxylgruppe des Substrats, analog zur Aconitase, wirken könnte. In der vorliegenden Arbeit konnte hierfür ein Indiz durch Mössbauerstudien erbracht werden. Weder ENDOR- noch EPR-Studien konnten bisher eine Cluster-Substratinteraktion oder die postulierten Substratradikalintermediate nachweisen. Untersuchungen mit UV-Vis-Spektroskopie des im oxidierten Zustand aktivsten Enzyms zeigen nach Zugabe verschiedener Substrate „charge-transfer“-Phänomene und einen unterschiedlich raschen Übergang zum Semichinonzustand. Die stereoselektive Synthese von 4-Hydroxy[4-3H,2H1]butyryl-CoA über 4-Oxo[4-2H1]butyrat ausgehend von Diethylformylsuccinat erlaubte die Untersuchung der Stereoselektivität der Eliminierung der Hydroxylgruppe. Die Analyse der Konfiguration der Methylgruppe des [4-3H,2H1]Crotonyl-CoA über chirale Essigsäure zeigte, dass die Wassereliminierung stereoselektiv mit Retention abläuft und bezüglich des -Protons als anti-Eliminierung beschrieben werden kann. Diese Resultate bestätigen somit das aus der Kristallstruktur abgeleitete Substratbindemodell. opus:2343 Fachbereich Biologie Clostridia doctoralThesis 2008 4-Hydroxybutyryl-CoA dehydratase [4-Fe-4S]cluster Friedrich, Peter Friedrich Peter https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2009/0109/cover.png German Clostridium aminobutyricum 2008-12-18 4-Hydroxybutyryl-CoA dehydratase is the key enzyme in the fermentation of 4-aminobutyrate to acetate, ammonia and butyrate in Clostridium aminobutyricum. The dehydratase was also detected in the 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutrate cycle in the archaeon Metallosphaera sedula acting as the missing link in the newly discovered 5th CO2 fixation pathway. The homotetrameric enzyme consists of 56 kDa subunits each containing one [4Fe-4S]-cluster and one FAD-cofactor. It catalyses the unusual reversible dehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA to crotonyl-CoA, which requires the abstraction of the unactivated -proton (pK ca. 40) of 4-hydroxybutyryl-CoA. The postulated mechanism via an enoxyradical intermediate, which together with hydrogen bonding to the thioester carbonyl lowers the pK to 8, was examined in EPR-studies. Until now only the semiquinone radical and possibly a [4Fe-4S]+-cluster-signal could be detected but thus far there is no evidence for a substrate radical. The recently solved crystal structure revealed a great structural similarity to that of the medium chain acyl-CoA dehydrogenases. As there is no cocrystal with substrate yet, the medium chain acyl-CoA dehydrogenase was used to devise a substrate binding model for the 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase. The FAD cofactor, the [4Fe-4S]-cluster and the amino acid residues His292, Glu455 and Glu257 are located in the putative active site and therefore are possible catalytically active elements. The main goal of this work was to solve the substrate stereochemistry and to confirm the substrate binding model by investigation of cofactor interactions. To this end stereoselectively labelled 4-hydroxy[2-2H1]butyryl-CoAs derived from 3 benzyloxypropan-1-ol via chiral reduction with ALPINE-BORANETM and subsequent carbon chain elongation were synthesised. Analysis of the reaction products with MALDI-TOF-MS showed loss of the 2Re-proton. Together with the previously determined abstraction of the 3Si-proton it could be demonstrated that the 4-hydroxybutyryl-CoA dehydratase and the medium chain acyl-CoA dehydrogenase share the same stereoselectivity. The unusual coordination of Fe1 of the cluster with His292 implies an aconitase like function as a Lewis acid in the abstraction of the substrate’s hydroxyl group. In this work this was supported by the Mössbauer studies. So far neither ENDOR nor EPR studies could reveal a substrate-cluster interaction or a substrate derived radical intermediate. Examination with UV-vis spectroscopy of the enzyme in the oxidized most active state showed a charge transfer together with conversion to the semiquinone state at variable rates upon addition of various substrates. The stereoselective synthesis of 4-hydroxy[4-3H,2H1]butyryl-CoA via 4-oxo[4-2H1]butyrate starting from diethylformylsuccinate permitted the determination of the stereoselectivity of the elimination of the hydroxyl group. Analysis of the configuration of the methyl group of [4 3H,2H1]crotonyl-CoA via chiral acetic acid showed that the elimination of water proceeds stereoselectively with retention of configuration and can be described as anti-elimination regarding the -proton. These results confirm the substrate binding model derived from the crystal structure. Stereochemie Flavoenzym Stereochemistry Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg ppn:213598523 Ketylradikal 2009-05-06 Substratstereochemie und Untersuchungen zum Mechanismus der 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase aus Clostridium aminobutyricum Biologie monograph