Substratstereochemie und Untersuchungen zum Mechanismus der 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase aus Clostridium aminobutyricum

Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von 4 Aminobutyrat zu Acetat, Ammoniak und Butyrat in Clostridium aminobutyricum. Darüber hinaus wurde die Dehydratase im 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat Zyklus in Metallosphaera sedula als Bindeglied des bisher unen...

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Main Author: Friedrich, Peter
Contributors: Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratase ist das Schlüsselenzym in der Fermentation von 4 Aminobutyrat zu Acetat, Ammoniak und Butyrat in Clostridium aminobutyricum. Darüber hinaus wurde die Dehydratase im 3-Hydroxypropionat/4-Hydroxybutyrat Zyklus in Metallosphaera sedula als Bindeglied des bisher unentdeckten fünften CO2-Fixierungsweges nachgewiesen. Dieses außer Clostridien nun auch in Archaeen entdeckte Enzym ist ein Homotetramer, in dem jede der 56 kDa Untereinheiten einen [4Fe-4S]-Cluster und einen FAD-Kofaktor enthält. Es katalysiert die ungewöhnlich reversible Dehydratisierung von 4-Hydroxybutyryl-CoA zu Crotonyl-CoA, die die Abstraktion des nicht aktivierten -Protons (pK ca. 40) von 4-Hydroxybutyryl-CoA erfordert. Der postulierte Mechanismus über ein Enoxyradikalintermediat, das zusammen mit Wasserstoffbrückenbindungen zum Thioestercarbonyl den pK auf 8 absenkt, wurde in EPR-Studien untersucht. Es wurde substratinduziert bisher eindeutig nur das Flavinsemichinonradikal sowie möglicherweise ein [4Fe-4S]+-Cluster-Signal, jedoch kein Substratradikal nachgewiesen. Die Aufklärung der Kristallstruktur offenbarte große strukturelle Ähnlichkeiten zu den Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenasen. Obwohl bisher kein Kokristall mit Substrat vorliegt, kann daraus ein Substratbindemodell abgeleitet werden. Wie aus der Kristallstruktur hervorgeht, sind die für die Katalyse in Frage kommenden Aminosäurereste His292, Glu455 und Glu257 sowie der FAD-Kofaktor und der [4Fe-4S]-Cluster im hypothetischen aktiven Zentrum lokalisiert. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Substratstereochemie und Untersuchung der Interaktion mit den Kofaktoren zur Bestätigung des Bindemodells. Dafür wurden stereoselektiv isotopenmarkierte 4-Hydroxy[2-2H1]butyryl-CoA-Ester ausgehend von 3 Benzyloxypropan-1-ol über chirale Reduktion mit ALPINE-BORANETM und anschließender Kettenverlängerung synthetisiert. Untersuchungen der Reaktionsprodukte mit MALDI-TOF-MS zeigten eine Abstraktion des 2Re-Protons. Zusammen mit der zuvor festgestellten Abstraktion des 3Si-Protons kann nun für die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydratayse und die Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase dieselbe Stereoselektivität bestätigt werden. Die ungewöhnliche Koordinierung mit His292 zeigt, dass das Fe1 des Clusters als Lewis-Säure bei der Abstraktion der Hydroxylgruppe des Substrats, analog zur Aconitase, wirken könnte. In der vorliegenden Arbeit konnte hierfür ein Indiz durch Mössbauerstudien erbracht werden. Weder ENDOR- noch EPR-Studien konnten bisher eine Cluster-Substratinteraktion oder die postulierten Substratradikalintermediate nachweisen. Untersuchungen mit UV-Vis-Spektroskopie des im oxidierten Zustand aktivsten Enzyms zeigen nach Zugabe verschiedener Substrate „charge-transfer“-Phänomene und einen unterschiedlich raschen Übergang zum Semichinonzustand. Die stereoselektive Synthese von 4-Hydroxy[4-3H,2H1]butyryl-CoA über 4-Oxo[4-2H1]butyrat ausgehend von Diethylformylsuccinat erlaubte die Untersuchung der Stereoselektivität der Eliminierung der Hydroxylgruppe. Die Analyse der Konfiguration der Methylgruppe des [4-3H,2H1]Crotonyl-CoA über chirale Essigsäure zeigte, dass die Wassereliminierung stereoselektiv mit Retention abläuft und bezüglich des -Protons als anti-Eliminierung beschrieben werden kann. Diese Resultate bestätigen somit das aus der Kristallstruktur abgeleitete Substratbindemodell.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0109