Funktionelle Charaktersierung der Arginin Methyltransferase PRMT6

Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung der Histonmethyltransferaseaktivität von PRMT6. Trotz der Tatsache, dass PRMT6 im Zellkern lokalisiert ist und für einige andere PRMTs Histonmethylierung gefunden wurde, blieb die Argininmethylierung in Histonen durch PRMT6 bish...

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Main Author: Dawin Michael Hyllus
Contributors: Lars-Oliver Essen (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Molekularbiologie und Tumorforschung
Subjects:
MLL
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung der Histonmethyltransferaseaktivität von PRMT6. Trotz der Tatsache, dass PRMT6 im Zellkern lokalisiert ist und für einige andere PRMTs Histonmethylierung gefunden wurde, blieb die Argininmethylierung in Histonen durch PRMT6 bisher unerforscht. Es konnte hier gezeigt werden, dass PRMT6 in vitro die Histone H3, H2A und H4 methyliert. Während ungebundene Histonproteine Substrate von PRMT6 waren, traf dies für Histone in Nukleosomen in vitro nicht zu. Die Methylierungsstellen konnten in den N-Termini der Histone lokalisiert werden und als R2 in Histon H3 sowie R3 in Histon H4 und H2A identifiziert werden. Bei der Charakterisierung des Methylierungsmechanismus ergab sich eine Präferenz von PRMT6 für monomethylierte Arginine, was die PRMT6 als Methyltransferase ausweist, welche bevorzugt die Dimethylierung von Argininen katalysiert. In Bezug auf die Methylierung des R2 konnten Einflüsse benachbarter Methylierungen auf die in vitro PRMT6-Aktivität ausgemacht werden. So wirkten die Methylierungen an K4 und K9 inhibierend, während die Methylierung des K27 einen schwachen positiven Effekt zeigte. Das daran anschließende Ziel bestand in der Untersuchung der Funktion der H3R2 Dimethylierung im Zusammenhang des Histoncodes. Es sollten mögliche Bindungsproteine (Effektor-Proteine) für diese Modifikation gefunden werden. Dazu wurden Peptid-Pulldowns mit synthetisch modifizierten H3-Peptiden durchgeführt und nach differentiell bindenden Proteinen gesucht. Diese Methode konnte allerdings keine spezifischen Interaktionspartner identifizieren. Auch ein vermuteter Zusammenhang zwischen der PRMT6 und dem PRC2-Komplex, sowie den entsprechenden Modifikationen an R2 und K27 konnte mittels dieser Peptid-Pulldowns nicht betätigt werden. Frühere Studien der Lokalisation der R2 Di- bzw. der K4 Trimethylierung an bestimmten Genpromotoren sowie Untersuchungen der Genexpression von c-Myc Zielbzw. HoxA Genen bei PRMT6 Überexpression lieferten Hinweise auf einen repressiven Effekt der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung. Zur weiteren Überprüfung dieses Mechanismus wurde zuerst die Genregulation des c-Myc Gens durch den Wnt- Signalweg untersucht. Dabei konnte durch RNAi-vermittelte Depletion kein Einfluss der PRMT6 auf die Genexpression dieses Gens gefunden werden.Um den negativen Effekt der R2 Dimethylierung auf die Trimethylierung des K4 auf mechanistischer Ebene zu beschreiben, wurde die in vitro Aktivität der K4 Trimethyltransferase MLL sowie die Histon H3 Interaktion der MLL-Komplexkomponente WDR5 in Abhängigkeit von der R2 Dimethylierung untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl die Methyltransferaseaktivität von MLL wie auch die Bindung des WDR5 an den Histon H3 N-Terminus durch eine Dimethylierung des R2 verhindert wird. Der inhibitorische Effekt der R2 Methylierung auf die Methylierung des K4 konnte spezifisch durch Chromatin-IPs in vivo am HoxA2 Promotor nachgewiesen werden, wo eine PRMT6 Überexpression zu verstärkter PRMT6 Rekrutierung und R2 Dimethylierung führte. Diese wiederum hatte die verminderte Assoziation von MLL und WDR5 mit diesem Promotor zur Folge und somit eine Reduktion der Trimethylierung des K4. In einem Modell neuronaler Differenzierung konnten diese Ereignisse am HoxA2 Gen bestätigt werden und zusätzlich die repressive Funktion der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung auf die Genexpression aufgezeigt werden. Zusammenfassend charakterisieren die Daten dieser Arbeit PRMT6 als neue Histonmethyltransferase, die R2 in Histon H3 dimethyliert. Desweiteren wurde eine spezifische Genregulationsfunktion der PRMT6 im Zusammenhang mit dem Histon- Code identifiziert, bei welcher die H3K4Me3-vermittelte Expression bestimmter Genpromotoren durch die H3R2Me2 reprimiert wird.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0107