Experimentelle Ansätze zur Untersuchung spezifischer Prozessierung extrazytoplasmatischer Proteine durch drei allele Signalpeptidasen aus Bradyrhizobium japonicum

Aus Vorarbeiten mit ausgesuchten rekombinanten Klonen einer E-Tag Expressionsgen-Fusionsbank gingen mehrere Genunterbrechungsmutanten von B. japonicum hervor, die einen auffälligen symbiotischen Phänotyp aufwiesen. In drei voneinander verschiedenen methodischen Ansätzen wurde die Bedeutung von Genen...

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Main Author: Nilles, Patrick
Contributors: Maier, Uwe G. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2009
Biologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Aus Vorarbeiten mit ausgesuchten rekombinanten Klonen einer E-Tag Expressionsgen-Fusionsbank gingen mehrere Genunterbrechungsmutanten von B. japonicum hervor, die einen auffälligen symbiotischen Phänotyp aufwiesen. In drei voneinander verschiedenen methodischen Ansätzen wurde die Bedeutung von Genen für extrazytoplasmatische Proteine aus B. japonicum bei der Ausbildung einer effektiven Symbiose mit der Sojabohne (Glycine max) untersucht. Zum einen wurde durch ein spezifisches DNA-Amplifikationsverfahren der Nachweis erbracht, dass die untersuchten Stämme jeweils tatsächlich die vermuteten Manipulationen der betroffenen Genregionen aufwiesen. Zum zweiten wurde in dem Sonderfall der nex18-Genregion, die im B. japonicum Genom zwei Mal in identischer Form – jedoch an verschiedenen Positionen – vorliegt, eine Mutationsstrategie mit dem Ziel entwickelt, Einzel- und Doppelmutanten zu konstruieren. Das im Wurzelknöllchen (nodule) exprimierte Gen nex18 wurde zunächst in S. meliloti identifiziert und als bedeutsam für eine effektive Symbiose beschrieben. Die flankierenden Bereiche der entsprechenden Genregionen aus B. japonicum wurden amplifiziert und mit zentralen Resistenzkassetten (SmR bzw. KmR) ausgestattet. Durch zweifache homologe Rekombination wurde der intakte ORF bll5191 durch die Streptomycin-Resistenzkassette ersetzt. Das zweite Gen (blr2474) konnte bislang nicht durch eine entsprechend vorbereitete KmR-Kassette eliminiert werden. Die Klone der E-Tag Expressionsgenbank kodieren in der Regel für Proteine mit N terminalem Signalpeptid. Da in B. japonicum drei verschiedene Signalpeptidasegene existieren und Mutationen in diesen Genen sich unterschiedlich auf die Symbioseeigenschaften auswirken, sollte die Frage untersucht werden, ob und wie eine Substratspezifität zwischen den Signalpeptidasen und den noch zu prozessierenden Vorläuferproteinen ausgeprägt ist. Um einen möglichst großen Teil der E-Tag- Fusionsproteine aus B. japonicum in E. coli testen zu können, sollten genetisch stabile und definierte Stammderivate konstruiert werden, in denen jeweils eine der drei Signalpeptidasen aus B. japonicum die singuläre Leaderpetidase von E. coli ersetzt. Obwohl durch spezifische PCR-Technik und DNA-Sequenzierung gezeigt werden konnte, dass der Genaustausch wie erwünscht erfolgt ist, beweisen DNA-Hybridisierungen und PCR-Amplifikate, dass die Stammkonstrukte weiterhin eine intakte lepB Kopie beinhalten. Ob hier eine vollständige oder partielle Duplikation des Bakterienchromosoms vorliegt, bleibt zur Klärung durch weiterführende Experimente offen.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2009.0100