An analysis of two-component regulatory systems in Myxococcus xanthus

Proteins of two-component regulatory systems (TCS) have essential functions in the sensing of external and self-generated signals in bacteria as well as in the generation of appropriate output responses. Accordingly, in Myxococcus xanthus TCS are important for fruiting body formation and sporulation...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Shi, Xingqi
Beteiligte: Sogaard-Andersen, Lotte (Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2008
Biologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Inhaltsangabe:
  • Proteine in Zweikomponentensystemen (Two-component systems, TCS) haben essentielle Funktionen bei der Detektion externer und interner Signale in Bakterien sowie bei der Erzeugung geeigneter Reiz-Antworten. Dementsprechend erfüllen Zweikomponentensysteme auch bei der Fruchtkörperbildung, Sporulation und Motilität von Myxococcus xanthus wichtige Aufgaben. In der vorliegenden Arbeit wurde das Genom von M. xanthus auf das Vorhandensein und die genetische Organisation von Zweikomponentensystemen untersucht. 272 Gene für Proteine aus Zweikomponentensystemen wurden identifiziert, darunter 21 Gene in acht verschiedenen Loci für Che-ähnliche Systeme. Die weitere Analyse wurde auf die 251 nicht Che-ähnlichen Proteine konzentriert, wovon 118 Histidinkinasen (Histidine Protein Kinases, HPKs), 119 Regulatoren (Response Regulators, RRs) und 14 HPK-ähnliche Gene sind. 71% der Gene für Zweikomponentensysteme sind ungewöhnlich als verwaiste Gene (orphan genes) organisiert oder in komplexen Gen-Clustern angeordnet, während die verbleibenden 29% der Gene eine gewöhnliche paarweise Organisation aufweisen. Bioinformatische Analysen legen nahe, dass sich TCS-Proteine, die von verwaisten Genen kodiert werden oder aus komplexen Gen-Clustern stammen, funktionell von TCS-Proteinen unterscheiden, die von Genpaaren kodiert werden. Microarray-Daten und qRT-PCR-Experimente weisen darauf hin, dass verwaiste TCS-Gene unter den TCS-Genen überrepräsentiert sind, deren Transkription während der Fruchtkörperbildung verändert ist. Die genetische Analyse von 25 verwaisten HPKs, die während der Entwicklung verstärkt gebildet werden, führte zur Identifikation zweier HPKs, die wahrscheinlich für die Lebensfähigkeit von M. xanthus essentiell sind sowie sieben HPKs, darunter vier neue, die eine wichtige Funktion bei der Fruchtkörperbildung oder Sporenkeimung haben. Im Bestreben, die verwaisten TCS-Proteine von M. xanthus funktionell miteinander zu verbinden, habe ich mich in dieser Arbeit auf den Response-Regulator FruA konzentriert, der eine Schlüsselrolle bei der Übertragung des C-Signals spielt. Zwei verschiedene Ansätze wurden verfolgt, um die FruA-Kinase zu identifizieren. Der erste Ansatz beruht auf der Annahme, dass ein FruA-Kinase-Gen Eigenschaften vom fruA-Gen aufweist, das heißt, dass es verwaist ist, seine Transkription während der Entwicklung verstärkt ist und eine Nullmutante in der Entwicklung gehemmt ist. Zusätzlich wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, um mögliche Interaktionen zwischen FruA und den entwicklungsbedingt regulierten, verwaisten HPKs zu untersuchen. Drei hervorragende FruA-Kinase-Kandidaten (SdeK, Hpk8 und Hpk12) und vier möglicherweise redundante Kandidaten (Hpk9, Hpk11, Hpk13 und Hpk29) wurden identifiziert. In vivo-Analysen der besten drei FruA-Kinase-Kandidaten führten zu einem Modell, in dem SdeK die Haupt-FruA-Kinase ist, Hpk12 eine untergeordnete FruA-Kinase und Hpk8 eine Phosphatase von FruA~P ist. Darüber hinaus könnte SdeK weitere Zielproteine haben, die im Entwicklungszyklus FruA nachfolgen, und es könnte zudem weitere HPKs geben, die FruA phosphorylieren oder mit FruA interagieren. Um die Interaktion zwischen FruA und den FruA-Kinase-Kandidaten in vitro direkt nachzuweisen, wurden die entsprechenden Proteine aufgereinigt. Es wurde gezeigt, dass Hpk8 und Hpk12 in vitro autophosphorylieren. Bemerkenswerterweise wird Hpk8 offensichtlich nicht am konservierten Histidin-Rest, sondern wahrscheinlich an einem Tyrosin-Rest phosphoryliert. Vorläufige Ergebnisse von einem Phosphotransfer-Essay legen nahe, dass Hpk8 entweder am Phosphoryltransfer zu FruA beteiligt ist oder FruA direkt phosphoryliert. Eine Interaktion von SdeK und Hpk12 mit FruA in vitro muss noch nachgewiesen werden. Hpk37 gehört zur Gruppe der verwaisten HPKs, deren Transkription während der Entwicklung verstärkt wird und die für die Entwicklung essentiell sind. Hefe-Zwei-Hybrid-System-Analysen zum Nachweis einer direkten Interaktion mit FruA waren jedoch nicht aussagekräftig. In vivo-Analysen zeigten, dass Hpk37 sowohl an der Produktion von (p)ppGpp als auch an der Antwort auf (p)ppGpp oder am A-Signaltranduktionsweg beteiligt sein könnte, sodass es wahrscheinlich keine FruA-Kinase ist. Untersuchungen der Protein-Domänen von Hpk37 und der genetischen Organisation des hpk37-Locus weisen übereinstimmend darauf hin, dass die Regulation der Aktivität von Hpk37 Methylierungs- bzw. Demethylierungsreaktionen einschließt, ähnlich den Adaptierungsreaktionen bei der Chemotaxis. In einem zweiten Ansatz wurde eine in silico-Methode (White et al., 2007) zur Identifikation von FruA-Kinasen verwendet. In vivo-Analysen von Mutanten der sechs besten FruA-Kinase-Kandidaten weisen stark darauf hin, dass diese HPKs keine FruA-Kinasen sind.