Die p300 Protein Acetyltransferaseaktivität supprimiert eine dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus ähnliche Autoimmunerkrankung in Mäusen

p300, als eine von 15 beschriebenen Acetyltransferasen der Mammalia, besitzt zahlreiche Interaktionspartnern, die gleichzeitig als Substrate der Acetylierung fungieren. Unter diesen sind Proteine, die in der Hämatopoese eine essentielle Rolle spielen. Eine konditionelle Knock-In-Maus mit heterozygot...

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Main Author: Forster, Nicole
Contributors: Eilers, Martin (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Molekularbiologie und Tumorforschung
Subjects:
SLE
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:p300, als eine von 15 beschriebenen Acetyltransferasen der Mammalia, besitzt zahlreiche Interaktionspartnern, die gleichzeitig als Substrate der Acetylierung fungieren. Unter diesen sind Proteine, die in der Hämatopoese eine essentielle Rolle spielen. Eine konditionelle Knock-In-Maus mit heterozygoter Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 (p300AS) in der Keimbahn ist embryonal letal, wohingegen heterozygote Knock-Out-Mäuse für p300 und embryonale Stammzellen, die homozygot für die Mutation waren, lebensfähig sind. Des Weiteren sind mehrere Mutationen der p300-Acetyltransferaseaktivität in Leukämien bekannt. Zusammenfassend lassen diese Daten eine Rolle der p300-Acetyltransferaseaktivität in der Hämatopoese der Mäuse vermuten. Daher wurde mit dieser Arbeit die Funktion der p300-Acetyltransferaseaktvität während der B-Zell-Entwicklung und -Differenzierung untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass Mäuse mit Expression eines Acetyltransferase-defizienten p300 ausschließlich in B-Zellen aufgrund der Entwicklung einer Autoimmunerkrankung frühzeitig sterben. Diese Erkrankung ist in ihrer Pathologie ähnlich dem humanen Systemischen Lupus Erythematosus (SLE). Die pathologischen Erscheinungen der Mäuse umfassen eine Splenomegalie, Glomerulonephritis, Vaskulitis, Einlagerungen von Immunglobulinkomplexen in verschiedenen Organen und die Produktion von Autoantikörpern gegen dsDNA und andere nukleäre Antigene. Das frühere Sterben der Weibchen gegenüber den Männchen ist ein weiteres Merkmal des humanen SLE, bei dem über 90% der Patienten Frauen sind. Die fehlende p300-Acetyltransferaseaktivität in den B-Zellen führt neben einer reduzierten Anzahl an transitionellen und Marginalzonen-B-Zellen in der Milz zu einem partiellen Verlust der B-Zell-Differenzierung in den Mäusen. Mäuse mit einer induzierten ubiquitären Expression des mutierten p300 entwickeln ebenfalls eine SLE-ähnliche Autoimmunerkrankung. Daraus lässt sich schließen, dass die p300-Acetyltransferaseaktivität notwendig für die Regulation der Selbsttoleranz der B-Zellen sowie deren Differenzierung ist. Ebenso zeigt dies, dass die Acetyltransferaseaktivität von p300 die Ausbildung einer SLE-ähnlichen Autoimmunerkrankung supprimiert. Neben diesem Phänotyp der B-Zellen konnte ich zeigen, dass die B-Zellen mit Expression des Acetyltransferase-defizienten p300 dennoch in der Lage sind, in vivo Immunglobuline zu bilden, welche insbesondere für die Isotypen IgG2b und IgM erhöht sind. FACS-Analysen zeigen, dass die erhöhten Mengen an Immunglobulinen mit einer höheren Anzahl an aktivierten B-Zellen in der Milz dieser Mäuse korrelieren. Eine Analyse der humoralen Immunantwort gegenüber dem T-Zell-abhängigen Antigen Ovalbumin verdeutlicht eine bereits erhöhte Anzahl an Ovalbumin-spezifischen Antikörpern vor der Immunisierung. Wohingegen 14 Tage nach der Immunisierung die Primärantwort der Mäuse mit Acetyltransferase-defizientem p300 ähnlich der von den Kontrollmäusen ist. Im Gegensatz dazu wird bei der Erinnerungsantwort eine schwächere Bildung von Ovalbumin-spezifischen Antikörpern detektiert. Da die Mäuse mit B-Zell-spezifischer Expression von Acetyltransferase-defizientem p300 nach Gabe des Antigens Ovalbumin eine B-Zell-Aktivierung zeigen, wird zusätzlich die Proliferation der B-Zellen ex vivo nach Aktivierung verschiedener Signalwege untersucht. Alleinig nach Induktion des BCR-Signalweges durch Zugabe von α-IgM zur Quervernetzung des BCR proliferieren die B-Zellen schwächer. Die reduzierte Anzahl proliferativer Zellen wird dabei nicht durch eine erhöhte Apoptose verursacht. Daher deutet dies auf eine Hemmung der Proliferation durch die fehlende Acetyltransferaseaktivität von p300 hin, welches unter anderem durch eine im cDNA-Microarray detektierte Deregulation des BCR-Signalweges verdeutlicht wird. Biochemische Analysen des Effektes von Acetyltransferase-defizientem p300 auf den Acetylierungsstatus der Proteine zeigen keine globalen oder promotorspezifischen Veränderungen der Histon H3K18-Acetylierung in B-Zellen mit reduzierter p300-Acetyltransferaseaktivität auf. Allerdings ist eine reduzierte Acetylierung bei größeren Proteinen als Histonen nachweisbar. Dies deutet darauf hin, dass vermutlich andere Proteine als Histone die kritischen Substrate der p300-Acetyltransferaseaktivität in vivo sind. Für weitere Analysen stellte ich eine B-Zelllinie her, in die durch homologe Rekombination das mutierte p300AS eingeführt wird. Diese B-Zelllinie synthetisiert nachweislich das mutierte p300AS, welches in vitro eine reduzierte Acetyltransferase-aktivität aufweist. Mit Hilfe der Zelllinie sind nun weitere Versuche, wie Proteomanalysen, zur Identifikation der Substrate, die auf die p300-Acetyltransferaseaktivität angewiesen sind, möglich.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0921