Entwicklung einer neuen Methode zur chemo- und regioselektiven Cys-tag Modifikation von Proteinen mithilfe von gespaltenen Inteinen
Kurpiers, Thomas
Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die Selektivität des Einbaus in ein Zielprotein, wobei generell die strukturelle und funktionelle Integrität des zu untersuchenden Proteins durch die Modifikation erhalten bleiben soll. Traditionelle Biokonjugationstechniken bedienen sich beispielsweise häufig der Cysteinseitenkette, die aufgrund der einzigartigen chemischen Reaktivität der Thiolgruppe und des relativ geringen natürlichen Vorkommens in Proteinen ein geeignetes Ziel für Modifikationsreaktionen darstellt. Die Cysteinmodifikation mit verschiedenen funktionellen Gruppen verläuft jedoch nur in Proteinen mit einem einzigen Cysteinrest streng regioselektiv und kann deshalb für Proteine mit essentiellen oder mit mehreren Cysteinresten nur eingeschränkt oder gar nicht angewendet werden.
In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die dieses Problem der Regioselektivität in einer zweistufigen Reaktion durch Verwendung eines gespaltenen Inteins umgeht. Dabei wird in einem ersten Schritt zunächst ein Fusionsprotein, bestehend aus einem C-terminalen Inteinfragment und einer kurzen C-terminalen Exteinsequenz, mit einem einzelnen Cystein (Cys-tag) durch ein Thiol-spezifisches Reagenz mit der gewünschten Gruppe regioselektiv modifiziert. In einem zweiten Schritt wird dieser modifizierte Cys-tag mittels trans-Proteinspleißen über eine stabile Peptidbindung mit einem beliebigen Zielprotein, das als Fusion mit dem komplementären N-terminalen Inteinfragment hergestellt wird, verbunden. Dadurch, dass die Modifikationsreaktion getrennt von der Proteinspleißreaktion abläuft, bleiben Cysteinreste im Zielprotein durch diese Prozedur unbeeinflusst. Eine wichtige Voraussetzung für diese Technik ist die Verfügbarkeit von gespaltenen Inteinen mit mindestens einem Cystein-freien Inteinfragment. In dieser Arbeit wurde dazu zunächst das künstlich gespaltene Ssp DnaB Intein verwendet, das gute Spleißausbeuten in zeit- und temperaturabhängigen Spleißreaktionen liefert. Durch das Einführen eines Cysteinrestes in eine kurze C-Exteinsequenz konnte ein Cys-tag generiert werden, der sowohl mit verschiedenen Fluorophoren, als auch mit Biotin regioselektiv modifiziert werden konnte und die nachfolgende Spleißreaktion nicht beeinträchtigte. Auch die Cystein-haltigen Proteine β-Laktamase und Thioredoxin, konnten als Fusionsproteine mit dem N-terminalen DnaB Inteinfragment produziert und mit dem Cys-tag regioselektiv modifiziert werden. Ihre enzymatische Aktivität wurde dadurch nicht beeinflusst. Die spontane Bildung des aktiven Inteins aus den beiden komplementären Inteinhälften konnte ferner für die Modifikation eines ungereinigten Zielproteins in einem Zelllysat ausgenutzt werden.
In einer Weiterentwicklung dieser Methode konnte erstmals ein trans-spleißendes Intein aus dem Mxe GyrA Mini-Intein generiert und biochemisch charakterisiert werden. Die Spleißproduktbildung des gespaltenen GyrA Inteins verlief dabei im Vergleich zum zuvor verwendeten DnaB Intein zwar etwas langsamer, dafür aber mit deutlich besseren Ausbeuten. Für die C-terminale Cys-tag Modifikation von Proteinen konnten sowohl Fluorophore als auch Polyethylenglykol eingesetzt werden. Die Herstellung von regioselektiv Fluorescein-modifiziertem menschlichem Wachstumshormon gelang durch die Kombination aus der Cys-tag Technik mit einem Rückfaltungsprotokoll. In einem weiteren Beispiel konnte auch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase TycA regioselektiv mit Fluorescein modifiziert und anschließend gereinigt werden. Modifiziertes TycA zeigte in einem Produktbildungsassay unveränderte enzymatische Aktivität, verglichen mit einem vollständig rekombinant hergestellten TycA-Kontrollprotein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden verwendeten gespaltenen Ssp DnaB und Mxe GyrA Inteine orthogonal zueinander sind, d.h. beide Inteine bildeten unabhängig voneinander Spleißprodukt.
Philipps-Universität Marburg
Chemistry + allied sciences
urn:nbn:de:hebis:04-z2008-07268
opus:2171
https://doi.org/10.17192/z2008.0726
Protein splicing
urn:nbn:de:hebis:04-z2008-07268
opus:2171
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
Proteinspleißen
Fluorophore
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0726/cover.png
Kurpiers, Thomas
Kurpiers
Thomas
Development of a novel method for the chemo- and regioselective cys-tag modification of proteins using split inteins
Cysteine bioconjugation
Inteins
The chemo- and regioselective introduction of synthetic moieties into proteins is of fundamental importance in basic protein and biochemical research. Several techniques have been developed for this purpose, which differ in the nature of the synthetic moiety and the selectivity of its incorporation. A general important criterion is thereby that the structural and functional integrity of the protein under investigation is preserved. In the majority of traditional bioconjugate techniques the sulfhydryl group of cysteine residues provides the most important functional target for modifications, due to its unique chemical reactivity and low natural abundance in proteins. However, cysteine modification is strictly regioselective only in proteins with a single cysteine residue and becomes severely limited or even impractical for target proteins containing essential or multiple cysteines.
The approach outlined in this work circumvents the problem of regioselectivity by a two-step procedure using a split intein. In a first step, a fusion protein consisting of a C-terminal fragment of a split intein and a short cysteine-containing C-extein sequence (Cys-tag) is modified with a sulfhydryl-reactive probe. In a second step, this labelled Cys-tag is linked to a target protein, which was expressed in fusion with the complementary split intein fragment, with a native peptide bond by protein trans-splicing. Thus, the modification reaction proceeds prior to the attachment and therefore leaves other native cysteine residues in the target protein unaffected. One important prerequisite for this strategy is the absence of a cysteine in the respective intein fragment. In this work the artificially split Ssp DnaB intein was used initially, which showed good yields in time- and temperature-dependant splicing reactions. The introduction of a cysteine residue into the previously cysteine-free C-terminal extein sequence yielded a Cys-tag, that could be efficiently labelled with various fluorophores and biotin. Neither the modified Cys-tag nor the free cysteine itself in close proximity to the active site nucleophile of the intein had an effect on the splicing activity. Moreover, the cysteine-containing E. coli proteins β-lactamase and thioredoxin could be obtained as fusions with the N-terminal DnaB intein fragment and regioselectively labelled with fluorescent probes by retaining enzymatic activity. In addition, the spontaneous association of the complementary intein fragments into its active form could be used for the specific labelling of a crude protein in a cell lysate.
In a further development of this approach, an artificially split version of the Mxe GyrA mini-intein could be generated, biochemical characterized and used for the Cys-tag modification of proteins. For the GyrA intein, splice product formation proceeded with slightly slower rates, but with significantly higher yields, compared to the previously used DnaB intein. In addition to the modification with fluorpophores, proteins could also be modified with a polyethylene glycol moiety. The preparation of regioselectively fluorescein-labeled human growth hormone was achieved by the Cys-tag approach in combination with a renaturation protocol. The regioselective fluorescein-modification of the non-ribosomal peptide synthetase TycA served as another example, showing the broad potential of this approach. Modified and purified TycA showed the same enzymatic activity in a product formation assay compared to a recombinantly produced unmodified TycA control protein.
Moreover, the new artificially split Mxe GyrA intein was found to be orthogonal to the split Ssp DnaB intein, i.e. both inteins produced their respective splice products independently from each other.
Philipps-Universität Marburg
Fachbereich Chemie
German
Cysteinbiokonjugation
2008-08-05
2008
Spleißen
Chemie
2011-08-10
ths
Prof. Dr.
Mootz
Henning
Mootz, Henning (Prof. Dr.)
https://doi.org/10.17192/z2008.0726
monograph
Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die Selektivität des Einbaus in ein Zielprotein, wobei generell die strukturelle und funktionelle Integrität des zu untersuchenden Proteins durch die Modifikation erhalten bleiben soll. Traditionelle Biokonjugationstechniken bedienen sich beispielsweise häufig der Cysteinseitenkette, die aufgrund der einzigartigen chemischen Reaktivität der Thiolgruppe und des relativ geringen natürlichen Vorkommens in Proteinen ein geeignetes Ziel für Modifikationsreaktionen darstellt. Die Cysteinmodifikation mit verschiedenen funktionellen Gruppen verläuft jedoch nur in Proteinen mit einem einzigen Cysteinrest streng regioselektiv und kann deshalb für Proteine mit essentiellen oder mit mehreren Cysteinresten nur eingeschränkt oder gar nicht angewendet werden.
In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die dieses Problem der Regioselektivität in einer zweistufigen Reaktion durch Verwendung eines gespaltenen Inteins umgeht. Dabei wird in einem ersten Schritt zunächst ein Fusionsprotein, bestehend aus einem C-terminalen Inteinfragment und einer kurzen C-terminalen Exteinsequenz, mit einem einzelnen Cystein (Cys-tag) durch ein Thiol-spezifisches Reagenz mit der gewünschten Gruppe regioselektiv modifiziert. In einem zweiten Schritt wird dieser modifizierte Cys-tag mittels trans-Proteinspleißen über eine stabile Peptidbindung mit einem beliebigen Zielprotein, das als Fusion mit dem komplementären N-terminalen Inteinfragment hergestellt wird, verbunden. Dadurch, dass die Modifikationsreaktion getrennt von der Proteinspleißreaktion abläuft, bleiben Cysteinreste im Zielprotein durch diese Prozedur unbeeinflusst. Eine wichtige Voraussetzung für diese Technik ist die Verfügbarkeit von gespaltenen Inteinen mit mindestens einem Cystein-freien Inteinfragment. In dieser Arbeit wurde dazu zunächst das künstlich gespaltene Ssp DnaB Intein verwendet, das gute Spleißausbeuten in zeit- und temperaturabhängigen Spleißreaktionen liefert. Durch das Einführen eines Cysteinrestes in eine kurze C-Exteinsequenz konnte ein Cys-tag generiert werden, der sowohl mit verschiedenen Fluorophoren, als auch mit Biotin regioselektiv modifiziert werden konnte und die nachfolgende Spleißreaktion nicht beeinträchtigte. Auch die Cystein-haltigen Proteine β-Laktamase und Thioredoxin, konnten als Fusionsproteine mit dem N-terminalen DnaB Inteinfragment produziert und mit dem Cys-tag regioselektiv modifiziert werden. Ihre enzymatische Aktivität wurde dadurch nicht beeinflusst. Die spontane Bildung des aktiven Inteins aus den beiden komplementären Inteinhälften konnte ferner für die Modifikation eines ungereinigten Zielproteins in einem Zelllysat ausgenutzt werden.
In einer Weiterentwicklung dieser Methode konnte erstmals ein trans-spleißendes Intein aus dem Mxe GyrA Mini-Intein generiert und biochemisch charakterisiert werden. Die Spleißproduktbildung des gespaltenen GyrA Inteins verlief dabei im Vergleich zum zuvor verwendeten DnaB Intein zwar etwas langsamer, dafür aber mit deutlich besseren Ausbeuten. Für die C-terminale Cys-tag Modifikation von Proteinen konnten sowohl Fluorophore als auch Polyethylenglykol eingesetzt werden. Die Herstellung von regioselektiv Fluorescein-modifiziertem menschlichem Wachstumshormon gelang durch die Kombination aus der Cys-tag Technik mit einem Rückfaltungsprotokoll. In einem weiteren Beispiel konnte auch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase TycA regioselektiv mit Fluorescein modifiziert und anschließend gereinigt werden. Modifiziertes TycA zeigte in einem Produktbildungsassay unveränderte enzymatische Aktivität, verglichen mit einem vollständig rekombinant hergestellten TycA-Kontrollprotein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden verwendeten gespaltenen Ssp DnaB und Mxe GyrA Inteine orthogonal zueinander sind, d.h. beide Inteine bildeten unabhängig voneinander Spleißprodukt.
Proteinmodifikation
doctoralThesis
Modifikation [Biochemie]
Chemistry + allied sciences
Chemie
Entwicklung einer neuen Methode zur chemo- und regioselektiven Cys-tag Modifikation von Proteinen mithilfe von gespaltenen Inteinen
2008-11-24
150
application/pdf
Inteine
Proteindesign
Protein modification
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