Entwicklung einer neuen Methode zur chemo- und regioselektiven Cys-tag Modifikation von Proteinen mithilfe von gespaltenen Inteinen

Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die S...

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Main Author: Kurpiers, Thomas
Contributors: Mootz, Henning (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2008
Chemie
Subjects:
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Description
Summary:Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die Selektivität des Einbaus in ein Zielprotein, wobei generell die strukturelle und funktionelle Integrität des zu untersuchenden Proteins durch die Modifikation erhalten bleiben soll. Traditionelle Biokonjugationstechniken bedienen sich beispielsweise häufig der Cysteinseitenkette, die aufgrund der einzigartigen chemischen Reaktivität der Thiolgruppe und des relativ geringen natürlichen Vorkommens in Proteinen ein geeignetes Ziel für Modifikationsreaktionen darstellt. Die Cysteinmodifikation mit verschiedenen funktionellen Gruppen verläuft jedoch nur in Proteinen mit einem einzigen Cysteinrest streng regioselektiv und kann deshalb für Proteine mit essentiellen oder mit mehreren Cysteinresten nur eingeschränkt oder gar nicht angewendet werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die dieses Problem der Regioselektivität in einer zweistufigen Reaktion durch Verwendung eines gespaltenen Inteins umgeht. Dabei wird in einem ersten Schritt zunächst ein Fusionsprotein, bestehend aus einem C-terminalen Inteinfragment und einer kurzen C-terminalen Exteinsequenz, mit einem einzelnen Cystein (Cys-tag) durch ein Thiol-spezifisches Reagenz mit der gewünschten Gruppe regioselektiv modifiziert. In einem zweiten Schritt wird dieser modifizierte Cys-tag mittels trans-Proteinspleißen über eine stabile Peptidbindung mit einem beliebigen Zielprotein, das als Fusion mit dem komplementären N-terminalen Inteinfragment hergestellt wird, verbunden. Dadurch, dass die Modifikationsreaktion getrennt von der Proteinspleißreaktion abläuft, bleiben Cysteinreste im Zielprotein durch diese Prozedur unbeeinflusst. Eine wichtige Voraussetzung für diese Technik ist die Verfügbarkeit von gespaltenen Inteinen mit mindestens einem Cystein-freien Inteinfragment. In dieser Arbeit wurde dazu zunächst das künstlich gespaltene Ssp DnaB Intein verwendet, das gute Spleißausbeuten in zeit- und temperaturabhängigen Spleißreaktionen liefert. Durch das Einführen eines Cysteinrestes in eine kurze C-Exteinsequenz konnte ein Cys-tag generiert werden, der sowohl mit verschiedenen Fluorophoren, als auch mit Biotin regioselektiv modifiziert werden konnte und die nachfolgende Spleißreaktion nicht beeinträchtigte. Auch die Cystein-haltigen Proteine β-Laktamase und Thioredoxin, konnten als Fusionsproteine mit dem N-terminalen DnaB Inteinfragment produziert und mit dem Cys-tag regioselektiv modifiziert werden. Ihre enzymatische Aktivität wurde dadurch nicht beeinflusst. Die spontane Bildung des aktiven Inteins aus den beiden komplementären Inteinhälften konnte ferner für die Modifikation eines ungereinigten Zielproteins in einem Zelllysat ausgenutzt werden. In einer Weiterentwicklung dieser Methode konnte erstmals ein trans-spleißendes Intein aus dem Mxe GyrA Mini-Intein generiert und biochemisch charakterisiert werden. Die Spleißproduktbildung des gespaltenen GyrA Inteins verlief dabei im Vergleich zum zuvor verwendeten DnaB Intein zwar etwas langsamer, dafür aber mit deutlich besseren Ausbeuten. Für die C-terminale Cys-tag Modifikation von Proteinen konnten sowohl Fluorophore als auch Polyethylenglykol eingesetzt werden. Die Herstellung von regioselektiv Fluorescein-modifiziertem menschlichem Wachstumshormon gelang durch die Kombination aus der Cys-tag Technik mit einem Rückfaltungsprotokoll. In einem weiteren Beispiel konnte auch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase TycA regioselektiv mit Fluorescein modifiziert und anschließend gereinigt werden. Modifiziertes TycA zeigte in einem Produktbildungsassay unveränderte enzymatische Aktivität, verglichen mit einem vollständig rekombinant hergestellten TycA-Kontrollprotein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden verwendeten gespaltenen Ssp DnaB und Mxe GyrA Inteine orthogonal zueinander sind, d.h. beide Inteine bildeten unabhängig voneinander Spleißprodukt.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2008.0726