urn:nbn:de:hebis:04-z2008-01448 ths Prof. Dr. Buckel Wolfgang Buckel, Wolfgang (Prof. Dr.) English Butyryl-CoA dehydrogenase Crotonyl-CoA https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2008/0144/cover.png Butyrate [Buttersäuresalze] Enzyme aus zwei Aminosäure Fermentationswege in Clostridien Zwei Enzyme der Alanin-Fermentation von Clostridium propionicum wurden aufgereinigt und biochemisch untersucht. Das Enzym (R)-Lactyl-CoA Dehydratase, das eine chemisch schwierige Wasserabspaltung von (R)-Lactyl-CoA zum Acrylyl-CoA katalysiert, konnte unter strikt anaeroben Bedingungen partiell aufgereinigt werden. Grüne Fraktionen der Komponente D und dunkle braune Fraktionen der Komponente A (Aktivator) wurden erhalten. Über MALDI Massenspektrometrie konnte Lactyl-CoA (m/z = 840), das Hydratysierungsprodukt von Acrylyl-CoA nachgewiesen werden. Dazu wurde Acrylyl-CoA, Komponente D und Komponente A in Anwesenheit von ATP, Mg2+ und Dithionit inkubiert. Ein zweites Enzym der Alanin-Fermentation, das die Addition con Ammoniak an Acrylyl-CoA katalysiert, wurde identifiziert. Die spezifische Aktivität der beta-Alanyl-CoA-Ammonia-Lyase ist im Extrakt von Zellen, die auf -Alanin gewachsen waren, 143 U mg-1 während auf D,L-Alanin gewachsene Zellen nur 0,44 U mg-1 enthielten. Daher konnte das Enzym über eine einzige Source 15-Q Säule aus -Alanin gewachsenen Zellen leicht gereinigt werden. Das Enzym hat eine native molekulare Masse von 95 kDa und ist aus sechs 16 kDa Untereinheiten zusammengesetzt (alpha6). Es zeigt eine hohe spezifische Aktivität für Acrylyl-CoA (Km = 23 µM; Vmax 1000 U mg-1) unabhängig von der Ammoniak-Konzentration (Km = 70 mM) Das hohe kcat/Km = 107 M-1 s-1 zeigt, dass die Reaktion beinahe diffusionslimitiert ist. Die Abspaltung von Ammoniak in der Rückreaktion (beta-alanyl-CoA Km = 210 µM) in wird in Anwesenheit von 100 mM NH4Cl bei gleichem beta-alanyl-CoA Km Wert zu 70 % gehemmt. Das Enzym, das die Reduktion von Crotonyl-CoA zum Butyryl-CoA in der Glutamat Fermentation von Clostridium tetanomorphum über 3-Methylaspartat katalysiert, wurde zusammen mit einen „Electron transfer flavoprotein“ (ETF) aufgereinigt. Der Komplex Butyryl-CoA-Dehydrogenase-ETF, ist ein alpha,beta,gamma-Heteromer (m = 360 kDa), das aus drei unterschiedlichen Untereinheiten aufgebaut ist: die 40 kDa alpha-Untereinheit (Butyryl-CoA-Dehydrogenase), die 36 kDa beta-Untereinheit (ETF alpha-Untereinheit) und die 28 kDa gamma-Untereinheit (ETF beta-Untereinheit). Das Enzym enthält weniger als 1 mol FAD, aber es nimmt bis zu 2 zusätzliche FAD Moleküle auf. Der gereinigte Enzym-Komplex zeigt Butyryl-CoA-Dehydrogenase Aktivität (1 U mg-1) mit Ferricenium als Elektronenakzeptor und Diaphorase Aktivität unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Wenn 50 µM FAD im Test zugesetzt worden war, konnte mit NADH bei einer gleichzeitigen geringen Diaphorase-Aktivität (1 U mg-1) Crotonyl-CoA-Reduktase Aktivität bei 340 nm anaerob nachwiesen werden (20 U mg -1). Mit Immuno-goldlabelling-Elektronmikroskopie war der Komplex hauptsächlich im Zytoplasma des Bakteriums lokalisiert worden. Das Ergebnis ist mit einer direkten Beteiligung der exergonen Crotonyl-CoA-Reduktion an der Energiekonservierung über eine elektrochemischen Protonengradienten unvereinbar. Darüber hinaus ebnete es den Weg zu der Entdeckung einer dritten Art der Energiekonservierung. Herrmann Twarz, Gloria Eloisa Herrmann Twarz Gloria Eloisa 2008-05-16 Life sciences Biowissenschaften, Biologie 2008-04-18 Glutamate 2008 opus:1967 Two enzymes of the alanine fermentation pathway of Clostridium propionicum were purified and biochemically characterized. The enzyme (R)-lactyl-CoA dehydratase catalyzing the difficult dehydration reaction of (R)-lactyl-CoA to acrylyl-CoA could be partially purified under strict anaerobic conditions. Green fractions of component D and dark brown fractions of component A (activator) were obtained in separate enzyme pools. Lactyl-CoA was identified in MALDI mass spectrometry (m/z = 840) as product of the hydration reaction after assaying lactyl-CoA dehydratase activity by mixing component D and component A in presence of acrylyl-CoA, ATP, Mg+2 and dithionite. A second enzyme of the alanine fermentation pathway was identified catalyzing the ammonification of acrylyl-CoA in the same micro-organism. Beta-Alanyl-CoA ammonia-lyase activity is 300-fold increased in cell-free extracts of beta-alanine grown cells (143 U mg-1) as compared to their D,L-alanine counterparts (0.44 U mg-1). Therefore the enzyme was readily purified from beta-alanine grown cells and a high final specific activity (1033 U mg-1) was found after one Source 15-Q anion exchange column. The enzyme has a molecular size of 95 kDa and is composed of six 16 kDa subunits (alpha6). It shows high catalytic activity towards acrylyl-CoA (Km = 23 µM) independently of the ammonia concentration (Km = 70 mM) at almost limiting diffusion rate conditions (kcat/Km = 107 M-1 s-1). In the reverse reaction the elimination of ammonia (beta-alanyl-CoA Km = 210 µM) is apparently 70 % inhibited at 100 mM NH4Cl while the Km for beta-alanyl-CoA remains unchanged. In the glutamate fermentation pathway via 3-methylaspartate, the enzyme catalyzing the reduction of crotonyl-CoA to butyryl-CoA was purified from Clostridium tetanomorphum in a complex with the electron transfer flavoprotein (ETF). Butyryl-CoA dehydrogenase-ETF was characterized as a 360 kDa alpha,beta,gamma-heteromer composed of three different subunits: the 40 kDa alpha-subunit (butyryl-CoA dehydrogenase) the 36 kDa beta-subunit (ETF alpha-subunit) and the 28 kDa gamma-subunit (ETF beta-subunit). Flavin content was less than 1 mol FAD but the enzyme could be reconstituted with additional FAD (2 mol) after one hour incubation at saturation conditions. The purified BCD-ETF complex presents butyryl-CoA dehydrogenase activity with ferricenium as electron acceptor (1 U mg-1) and diaphorase activity in both oxic and anoxic atmospheres. Crotonyl-CoA reduction (20 U mg-1) could be measured anoxically at 340 nm only in the presence of additional FAD (50 µM) and the concomitant diaphorase activity was approximately 1 U mg-1. In situ localization using immuno- and electron microscopy techniques revealed that the complex is evenly distributed over the cytoplasma of the bacteria. This result excludes a direct involvement of the exergonic crotonyl-CoA reduction in energy conservation via an electrochemical ion gradient. Further it paved the way to the discovery of a third mode of energy conservation Electron-transfer-flavoprotein monograph Philipps-Universität Marburg Fermentation 2011-08-10 Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg doctoralThesis Biologie 103 application/pdf Enzymes of two clostridial amino-acid fermentation pathways Fachbereich Biologie ppn:198832435 Flavine Ferredoxin https://doi.org/10.17192/z2008.0144