Transcriptional activation and sensing propertiesof DegS-DegU: a two-component system involvedin the osmotic regulation of Bacillus subtilis

Wasserverfügbarkeit ist wichtig für die Entwicklung lebender Zellen. Verschiedene physikalische und chemische Parameter, wie niedrige Wasserverfügbarkeit und hyperosmotischer Stress führen zu zellulärer Dehydration. Die Mechanismen der zellulären Anpassung zur Vermeidung von Wasserverlust unter hyperosmotischen Bedingungen (Osmoregulation) sind in vielen Organismen intensiv untersucht worden. In Bacillus subtilis kontrolliert das Zwe-Komponenten System DegS-DegU verschiedenen Prozesse, welche charakteristisch für den Übergang von der exponentiellen zur stationieren Wachstumsphase sind. Dies sind unter anderem die Induktion extrazellulärer Abbauenzyme, die Expression von Genen für die Kompetenz, oder die negative Regulation des Sigma D Regulons, welches die Gene für die Bewegung, die Chemotaxis und die Autolysinproduktion umfasst. Das DegS-DegU System ist bislang das einzig bekannte, welches unter hyperosmotischen Bedingungen expremiert wird (Steil et al., 2003). In dieser Arbeit wird die Rolle dieses regulatorischen Zwei-Komponentensystems dahingehend untersucht, welche Rolle die Aktivierung durch Salz spielt. Northern-Blot Experimente und Daten aus Reportergenfusionen bestätigen, dass beide Gene, degS und degU, gemeinsam als Operon transkribiert werden. Zusätzlich existiert noch ein interner Promoter stromaufwärts von degU. Die Beteiligung des DegS-DegU Systems an der osmotischen Regulation wurde unterstütz durch die Akkumulation der mRNA von beiden Genen, wenn die Zellen unter hyperosmotischen Bedingungen kultiviert wurden. Für den internen degU Promoter konnte eine Aktivierung durch einen positiven Feedback-Mechanismus duerch das phosphorylierte DegU-Protein nachgewiesen werden. Untersuchungen des degSU Promoters in der Gegenwart verschiedener geladener und ungeladener Substanzen unter vergleichbaren osmotischen Verhältnissen zeigten, dass die Aktivierung des Systems ein osmotischer, und kein salzspezifischer Effekt ist. Außerdem scheint das DegS-DegU System nicht per se auf die Osmolarität zu reagieren, da die Zugabe des potenten Osmoprotektivums Glycin-Betain keinen Einfluss hat und die korrespondieren Gene weiterhin induziert bleiben. Die zytoplasmatische Lokalisation von DegS wirft folgende Frage auf: was sind die molekularen Mechanismen, die der Wahrnehmung eines Sidnals aus der Umwelt und ihrer Weterleitung zur Sensorkinase zugrunde liegen. Um dieser Frage nachzugehen, wurden beide Proteine chromatographisch gereinigt und in vitro Experimente etabliert, um eine detaillierte Analyse der DegS Eigenschaften durchzuführen. Die in vitro Unrtersuchungen der DegS Autokinase-Aktivität in Gegenwart einer Auswahl von Osmolyten mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften zeigten, dass die Sensorkinase nur in Gegenwart von Glutamat spezifisch stimuliert wird. Eine mögliche Rolle bei der Aktivierung der DegS Autophosphorylierung wurde auch durch die Tatsache unterstütz, dass Zellen nach osmotischen Veränderungen Glutamat direkt nach der Zugabe von NaCl zum Wachstumsmedium akkumulieren. Parallel wurde die Rolle des DegS-DegU Systems auf transkriptioneller und auf Proteinebene untersucht. Zur Identifikation möglicher weiterer, durch dieses System regulierter Gene, wurden zusätzliche Experimente durchgeführt. Die Verwendung des Wildtypstammes (degS degU) einer Hypermutante (degU32(Hy)) und einer Deletionsmutante (degS degU::aphA3) führten zur Identifizierung von neun Genen deren Transkription ansteigt, wenn die Zellen einer Umgebung mit hoher Osmolarität ausgesetzt werden. Die Expression dieser Gene ist außerdem abhängig von der Verfügbarkeit der degS und degU Genprodukte. Die Daten dieser Arbeit geben einen Einblick in die transkriptionelle Regulation von und durch das DegS-DegU Zweikomponrentensystem in B. subtilis und zeigen intrazelluläres Glutamat als einen positiven Stimulus bei der Weiterleitung von Informationen aus der Umwelt in das Zellinnere.