Molecular Characterization and Expression of Two New Members of the SLC10 Transporter Family: SLC10A4 and SLC10A5

Die „Solute Carrier” Familie SLC10 besteht über 10 Jahre aus zwei sehr gut charakterisierten Mitgliedern: Dem „Na+/Taurocholate Cotransporting Polypeptide“ NTCP (SLC10A1) und dem „Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter“ ASBT (SLC10A2). Diese Carrier haben eine essentielle physiologische Bedeutung in der Aufrechterhaltung des enterohepatischen Kreislaufs der Gallensäuren. Hierbei vermitteln sie den ersten Schritt der zellulären Aufnahme von Gallensäuren in Leber (NTCP) und Darm (ASBT). Vor kurzem konnten zwei weitere Mitglieder dieser Familie in unserer Arbeitsgruppe identifiziert werden, welche als „Sodium-dependent Organic Anion Transport“ SOAT (SLC10A6) und SLC10A7 bezeichnet wurden. Während SOAT sulfokonjugierte Steroidhormone und sulfokonjugierte Gallensäuren transportiert, konnte für den SLC10A7 bisher kein Substrat identifiziert werden. In dieser Studie wurden zwei weitere Mitglieder der SLC10 Familie entdeckt und als SLC10A4 und SLC10A5 bezeichnet (GenBank accession nos. AY825924, AY825925 und DQ074435). Diese Arbeit beschreibt die molekulare Klonierung, Expression und molekulare Analyse sowie die funktionelle Testung dieser neuen möglichen Membrantransporter. Die Proteinsequenzen von SLC10A4 und SLC10A5 bestehen aus 434-438 Aminosäuren bei Mensch, Ratte und Maus und sind damit viel länger ist im Vergleich zu den Proteinlängen anderer Mitglieder dieser Transporter-familie (340-377 Aminosäuren). Die Sequenzidentität/Sequenzähnlichkeit des SLC10A4 zu NTCP, ASBT und SOAT ist mit 29%/54% relativ hoch. Anderesseits ist die Identität/Ähnlichkeit des SLC10A5 am höchsten zu SLC10A3, welches ein bisher nicht charakterisiertes Mitglied der SLC10 Familie ist. Der Slc10a4 der Ratte zeigt eine Membrantopologie mit sieben Transmembrandomänen und einer Nexo/Ccyt trans-Orientierung, wohingegen der SLC10A5/Slc10a5 neun mögliche TMDs hat. Basierend auf „real time quantitativer PCR“ und Northern Blot Analysen lässt sich eine Expression von SLC10A4/Slc10a4 überwiegend im Gehirn feststellen, während SLC10A5/Slc10a5 in Leber und Niere stark exprimiert wird. Gegen den Slc10a4 der Ratte wurde ein polyklonaler Antikörper in Kaninchen generiert und mit diesem Western Blot und immunohistochemische Analysen durchgeführt. Eine Slc10a4-Immunoreaktivität wurde in den cholinergen Regionen des gesamten Zentralnervensystems der Ratte nachgewiesen. Co-Lokalisationsstudien mit den cholinergen Markern VAChT, ChAT und CHT1 bestätigen die Anwesenheit des Slc10a4 in den cholinergen Neuronen. Zusätzlich wurde das Slc10a4 Protein in zwei dopaminergen Regionen identifiziert: Substantia Nigra und Ventrales Tegmentales Areal. In diesen Regionen wird dieses Protein mit ChAT und dem catecholaminergen Marker Tyrosinhydroxylase co-exprimiert. Die Expression des Slc10a5 der Ratte wurde mit in situ Hybridisierung in den Hepatozyten und im proximalen Tubulus der Niere nachgewiesen. Die funktionelle Charakterisierung des Slc10a4 und SLC10A5/Slc10a5 wurde in X. laevis Oozyten und HEK293 Zellen durchgeführt. Die Expression beider Proteine konnte durch Nachweis eines C-terminalen FLAG Epitops mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie in der Plasmamembran bestätigt werden. Bisher konnte in den Transportstudien allerdings keine Transportaktivität von Slc10a4 und SLC10A5/Slc10a5 für Gallensäuren und Steroidsulfate, welche die typischen Substrate des NTCP, ASBT und SOAT sind, festgestellt werden. Wegen seiner hoher Verwandtschaft zu den Gallensäuretransportern und der Lokalisation in Leber und Niere vermuten wir, dass auch SLC10A5 eine Transportfunktion aufweist, dessen Substrat noch identifiziert werden muss. Hinsichtlich Slc10a4 konnte ich zeigen, dass dieses Protein auch kein cholin, ein Substrat des CHT1, transportiert. In dieser Arbeit konnten die funktionellen Eigenschaften des Slc10a4 nur teilweise geklärt werden. Allerdings scheint der Slc10a4 ein neues Markerprotein für cholinerge Neurone zu sein, welches ein unerwarteter Befund für ein Mitglied der „Sodium/Bile Acid Cotransporter“ Familie SLC10 ist.