Investigating the Assembly of Ribonucleoprotein complexes (RNPs)

Eukaryotische Zellen enthalten eine Vielzahl kleiner Ribonukleoproteinkomplexe (engl. Ribonucleoproteins, RNPs), die an verschiedenen RNA-Prozessierungsereignissen im Zellkern teilnehmen. Die spleißosomalen U1, U2, U5 und U4/U6 snRNP (engl. small nuclear RNPs) Partikel stellen hierbei eine Gruppe dar und katalysieren in einem definierten und dynamischen Prozess die Spleißreaktion. Bei dieser Reaktion werden die nichtcodierenden Bereiche (Introns) aus der Prä-mRNA herausgeschnitten und die codierenden Bereiche, die so genannten Exons, zu einer reifen mRNA verknüpft. Eine andere Gruppe wird von den C/D Box snoRNPs (engl. small nucleolar RNPs) des Nukleolus gebildet. Diese steuern die Prozessierung der ribosomalen RNA (rRNA) und sind an der ortsspezifischen 2' O-Methylierung von Ribosen beteiligt. Obwohl der U4/U6 snRNP Partikel und die C/D Box snoRNPs an unterschiedlichen Prozessen in der Zelle beteiligt sind, teilen sie sowohl eine ähnlich RNA Komponente als auch identische und ähnliche Proteine. Ihre RNA Komponente kann ein so genanntes kink-turn (k-turn) Motiv bilden (in der U4 5′ stem-loop; C/D und B/C Box Motiv in den C/D Box snoRNAs), das von dem allen RNPs gemeinsamen 15.5K Protein gebunden wird. Zusätzlich zu dem 15.5K Protein besitzt der U4/U6 snRNP Partikel und die C/D Box snoRNPs partikelspezifische Proteine. Der spleißosomale U4/U6 snRNP Partikel enthält neben sieben Sm- und sieben Lsm-Proteine, die jeweils mit der Sm-Bindungsstelle der U4 snRNA und dem 3' Ende der U6 snRNA assoziiert sind, vier weitere Proteine. Hierzu zählen das Protein hPrp31 (auch 61K) und drei weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 20, 60 und 90 kDa, welche den heteromeren hCypH/hPrp4/hPrp3 (auch 20/60/90K) Proteinkomplex bilden. Die C/D Box snoRNPs sind ebenfalls mit unterschiedlichen Proteinen assoziiert, welche die eigentliche rRNA Modifikationsreaktion durchführen. Sie besitzen sie die Proteine NOP56, NOP58, TIP48, TIP49 und Fibrillarin, die z.B. an die U8 und U14 C/D Box snoRNA binden. Die Proteine 15.5K und hU3-55K bilden den RNP-Komplex, der sich auf dem U3 C/D Box snoRNA-spezifischen B/C Box Motiv zusammenlagert. Die Zusammenlagerung der RNPs ist ein mehrstufiger Prozess, der von der Bindung des 15.5K Proteins an das jeweilige kink-turn Motiv initiiert wird. Das 15.5K Protein ist einzigartig in seiner Funktion als Komplexbildner für die hierarchische Zusammenlagerung der drei RNP Komplexe. Es interagiert mit dem verwandten k-turn Motiv über einen „induced-fit“ Mechanismus, der in einer Faltung der umliegenden RNA und der Bildung von Bindungsstellen für die RNP-spezifischen Proteine resultiert. Folglich spielen Protein-RNA Interaktionen, für die Bindung der assoziierten Proteine an den U4/U6 snRNP, den C/D Box snoRNP und den Partikel, der sich auf dem U3-spezifischen B/C Box Motiv zusammenlagert, eine wesentliche Rolle. Ob das 15.5K die RNP Bildung jedoch auch durch direkte Protein-Protein Wechselwirkungen mit den komplexspezifischen Proteinen vermittelt, war zu Beginn der vorliegenden Arbeit unklar. Um dieser Möglichkeit nachzugehen, wurde eine Reihe von Mutationen generiert, bei denen die Oberflächeneigenschaften des 15.5K Proteins verändert wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Effekt der Mutationen auf die Zusammenlagerung der RNPs hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Zusammenlagerung der drei untersuchten RNP Partikel eine Reihe verschiedener Regionen auf der 15.5K Oberfläche benötigt. Die dargestellten Ergebnisse legen daher nahe, dass direkte Protein-Protein-Interaktionen zwischen 15.5K und den verschiedenen komplexspezifischen Proteinen von Bedeutung sind. Diese Theorie wird ferner dadurch unterstützt, dass in den Studien eine direkte Interaktion zwischen dem 15.5K Protein und dem B/C Box-assoziierten Protein hU3-55K beobachtet werden konnte. Zusammenfassend legen die gewonnenen Daten nahe, dass die Zusammenlagerung der jeweiligen RNP Partikel eine direkte Erkennung von spezifischen Elementen – sowohl auf der 15.5K Proteinoberfläche als auch spezifischer RNA Elemente –einbezieht. Bei dem U4/U6-spezifischen Protein hPrp31 und den C/D Box-spezifischen Proteinen NOP56 und NOP58 handelt es sich um homologe Proteine, welche eine konservierte Domäne – die so genannte Nop-Domäne – gemeinsam haben. Zu Beginn dieser Arbeit war nicht bekannt wie hPrp31 und NOP56/NOP58 spezifisch jeweils an den U4/U6 snRNP und die C/D Box snoRNP Partikel binden können. Um diese Fragestellung zu behandeln, wurden die strukturellen Anforderungen für die Assoziation von Protein hPrp31 an den U4 snRNP Partikel untersucht. Unter Verwendung von U4 snRNA Punkt- und Deletionsmutanten wurden strukturelle Merkmale in der U4 snRNA bestimmt, welche für die Bindung des Proteins hPrp31 and den U4/U6 snRNP Partikel essentiell sind. Die Ergebnisse zeigen, dass die spezifische Bindung von hPrp31 an den U4 snRNP Partikel durch die RNA-Elemente „stem I“ und „stem II“ der U4 snRNA bestimmt wird, und legen einen Weg nahe, durch den hPrp31 und NOP56/NOP58 jeweils spezifisch an den U4/U6 snRNP und C/D Box snoRNP Partikel binden könnten. Die Ergebnisse erbrachten ferner den Nachweis, dass die Nop-Domäne für sich notwendig und darüber hinaus ausreichend für die Bindung des Proteins hPrp31 an den U4 snRNP Partikel ist. Sie legen zudem nahe, dass es sich bei dieser Domäne um eine neuartige RNA-bindende Domäne handelt. Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass das Protein hPrp31 auch von klinischem Interesse ist, da zwei Mutationen (A194E, A216P) im humanen hPrp31 Gen (PRPF31) mit der autosomal dominanten Form der Retinitis Pigmentosa in Zusammenhang gebracht werden konnten. Die Retinitis Pigmentosa ist eine Erkrankung, welche zu einer Degeneration der Photorezeptoren in der Netzhaut (Retina) des Auges führt. Es wurde kürzlich gezeigt, dass Protein hPrp31 eine Schlüsselrolle bei der U4/U6.U5 tri snRNP Assemblierung spielt, welche vermutlich in den Cajal Bodies (sphärischen Unterorganellen des Nukleus) stattfindet. Dennoch ist bis jetzt unklar, ob die hPrp31 Mutationen die Stabilität des tri-snRNP beeinträchtigen. Unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und biochemischen Methoden wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, wie die hPrp31 Mutationen sowohl die in vivo Lokalisierung als auch die U4/U6.U5 tri snRNP Assemblierung beeinflussen.