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Darstellung verschiedener Benzodiazepin-Glucuronide sowie die Testung der Benzodiazepine hinsichtlich ihres Interaktionspotentials im Phase-II-Metabolismus mit Opiaten
Die Glucuronide der Benzodiazepine (R,S)-Oxazepam, (R,S)-Temazepam und (R,S)-Lorazepam wurden durch enzymkatalysierte Synthese mit Hilfe von Schweinelebermikrosomen dargestellt. Das dabei jeweils entstandene Diastereomerengemisch, konnte durch präparative HPLC voneinander getrennt werden. Die result...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2007
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Die Glucuronide der Benzodiazepine (R,S)-Oxazepam, (R,S)-Temazepam und (R,S)-Lorazepam wurden durch enzymkatalysierte Synthese mit Hilfe von Schweinelebermikrosomen dargestellt. Das dabei jeweils entstandene Diastereomerengemisch, konnte durch präparative HPLC voneinander getrennt werden. Die resultierenden Syntheseprodukte wurden mit einer Ausbeute von 10-28 % erhalten, und mittels LC/MS und 1H-NMR spektroskopisch charakterisiert. Die durch ESI-MS experimentell bestimmten Feinmassen wiesen eine Fehlerabweichung von maximal 0,7 ppm im Vergleich zu den theoretischen Massen auf. MS2-Experimente belegten für alle Benzodiazepin-Glucuronide dieselbe charakteristische Fragmentierung. Unterschiede bezüglich der Stereochemie konnten mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie gezeigt werden. Dabei verhielten sich alle S-Glucuronide der Benzodiazepine gleich, was die chemische Verschiebung und das Aufspaltungsmuster der beiden unterschiedlichen Protonen an Position G1 und 3 anbelangt. Dasselbe gilt auch für alle R-Glucuronide. Die Verfügbarkeit der stereoisomerenreinen Benzodiazepin-Glucuronide als Referenzsubstanzen ermöglichte es Wechselwirkungsstudien im Phase-II-Metabolismus mit den Opiaten durchzuführen. Dazu wurde ein in vitro UGT-Assay mit humanen Lebermikrosomen (HLMs) entwickelt und nach Optimierung der Inkubationsbedingungen die enzymkinetischen Daten von (R,S)-Oxazepam und (R,S)-Temazepam bestimmt. Bei beiden S-Enantiomeren trat eine Substrathemmung auf. Die korrespondierenden R-Enantiomere zeigten den typischen Verlauf einer Michaelis-Menten-Kinetik. Die Affinität von Oxazepam zu den UDP-Glucuronosyltransferasen (UGTs) war höher ist als die von Temazepam. Beim Vergleich der beiden Enantiomerenpaare beider Wirkstoffe zeigte sich, dass die S-Konfiguration eine höhere Affinität als die R-Konfiguration zu den UGTs aufwies. Zusätzlich wurden Untersuchungen mit allen kommerziell verfügbaren UGT-Isoformen durchgeführt, um zu klären, welche Isoformen an der Umsetzung von R- und S-Temazepam beteiligt sind. Dies ermöglichte eine bessere Beurteilung der Ergebnisse aus den Inhibitionsversuchen, da die an der Umsetzung von Oxazepam beteiligten Isoformen bereits aus der Literatur bekannt waren. UGT2B7 katalysierte als einzige Isoform die Umsetzung zu R-Temazepam-Glucuronid und erwies sich aufgrund des niedrigen Km-Wertes als die bei dieser Umsetzung hauptsächlich beteiligte Isoform. Diese Isoform zeigte ebenfalls eine Affinität zu S-Temazepam, ebenso wie UGT2B15. Anhand der durchgeführten Versuche konnte jedoch nicht geklärt werden, welche die Hauptisoform für die Umsetzung von S-Temazepam darstellt. Unter den optimierten Inkubationsbedingungen wurden alle Inhibitionsversuche mit Morphin oder Codein und Oxazepam oder Temazepam durchgeführt. Die quantitative Bestimmung sowohl der Benzodiazepin-Glucuronide als auch der Opiat-Glucuronide ermöglichte es, gleichzeitig die Eigenschaften der Opiate und der Benzodiazepine sowohl als Substrate als auch als Inhibitoren der Glucuronidierung zu ermitteln. Alle untersuchten Substanzen erwiesen sich als kompetitive Inhibitoren. Dies ist wohl hauptsächlich in einer Konkurrenz um das aktive Zentrum der Isoform UGT2B7 begründet. Bei den Untersuchungen der Opiate als Inhibitoren der Benzodiazepin-Glucuronidierung erwies sich Codein als stärkerer Inhibitor mit niedrigeren Ki-Werten als Morphin. Es wurde gezeigt, dass die Glucuronidierung der S-Enantiomere von Oxazepam und Temazepam durch die Opiate Morphin und Codein im Vergleich zu den R-Enantiomeren stärker gehemmt wird. Oxazepam und Temazepam hemmten ihrerseits die Glucuronidierung von Codein in stärkerem Ausmaß als die Glucuronidierung von Morphin, sowohl zu Morphin-3- als auch zu Morphin-6-Glucuronid. Temazepam erwies sich gegenüber Oxazepam als stärkerer Inhibitor der Morphin-Glucuronidierung und hemmte die Glucuronidierung zu Morphin-3- und Morphin-6-Glucuronid in demselben Ausmaß. Die Gewinnung der diastereomerenreinen Temazepam-Glucuronide ermöglichte es weiterhin, erstmalig in vitro-Untersuchungen bezüglich ihrer pharmakologischen Aktivität durchzuführen. Die Wirksamkeit von Temazepam und seinen Phase-II-Metaboliten wurde mit einem zellbasierten Biosensor, der aus einem neokortikalen neuronalen Netzwerk besteht, untersucht. Im Falle von Temazepam konnte eine konzentrationsabhängige Abnahme der Burstrate beobachtet werden. R- und S-Temazepam-Glucuronid modifizierten die Netzwerkaktivität hinsichtlich der untersuchten Parameter nicht. Aufgrund dieser Untersuchungen kann angenommen werden, dass die Temazepam-Glucuronide keinen Einfluss mehr auf die Neuroaktivität ausüben. Der eingesetzte Biosensor erwies sich somit für Untersuchungen bezüglich der pharmakologischen Aktivität von Benzodiazepinen und ihren Phase-II-Metaboliten als geeignet. |
|---|---|
| Umfang: | 217 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2007.0700 |