Gentransfer und –regulation mit adeno-assoziierten Virusvektoren

Zusammenfassung Das Vektorsystem, basierend auf den adeno-assoziierten Viren, ist ein hoch attraktives Vektorsystem mit geringer biologischer Sicherheitsstufe (S1), da es keine bekannten Pathogenitätsfaktoren aufweist. Das Vektorsystem hat ein sehr breites Wirtsspektrum und ist aus diesem Grund un...

Ausführliche Beschreibung

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1. Verfasser: Pinkenburg, Olaf
Beteiligte: Vogelmeier, Claus (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2007
Innere Medizin
Schlagworte:
AAV
Online Zugang:PDF-Volltext
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language German
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Gentransfer
Medizin, Gesundheit
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Gentransfer und –regulation mit adeno-assoziierten Virusvektoren
Pinkenburg, Olaf
Summary The vector system based on the adeno-associated virus is a highly attractive system with a low biological security level because of its lack of pathogenic factors. The vector system has a broad tropism and for this reason is a universal tool. A vector system of this kind should first be analysed for its basic properties. After this the TETON- OFF system and RNAi technology should be combined with the viral system. Finally gene transfer should be demonstrated in an in vivo animal model. Basic properties such as the time course of gene transfer were estimated first. Here,it was possible to determine the exact temporal profile of virus uptake and the resulting gene expression in detail. The stability of gene expression after viral transduction and also the amount of integration were also determined. With these recombinant viruses it was also possible to create stabile cell lines.It was possible to combine the tetracycline inducible system with the AAV system. For the TET-OFF system, a seven-fold stronger induction of luciferase could be shown compared to the TET-ON system. The TET-ON system showed a ten-fold higher basal activity than the TET-OFF system. Using the TET-OFF system, it was possible to produce the antimicrobial peptide hCAP18 in HEK-293 cells and to detect it immunochemically. RNAi technology was also combined with the AAV system; there it was possible to show a dose as well as a time-dependent regulation of luciferase expression in HEK-293 cells. In this overexpression model, an siRNA against luciferase and a control siRNA were used. It was possible to downregulate luciferase activity by 95 %. The RNAi technology was also used to reduce IL8 expression after TNFα stimulation of epithelial cells by decreasing the p65 protein. Strong expression of hCAP18, as well as its release into the medium, was shown with two different AAV constructs in HEK-293 cells and also in primary HBE cells. For gene transfer in the animal model, a self-complementing AAV was used. The angiogenic properties of the hCAP18/LL37 were be shown in the chronic ischemic rabbit hindlimb model. After the gene transfer, a higher blood flow and a higher capillary density could be verified in the hindlimb tissue.
description Zusammenfassung Das Vektorsystem, basierend auf den adeno-assoziierten Viren, ist ein hoch attraktives Vektorsystem mit geringer biologischer Sicherheitsstufe (S1), da es keine bekannten Pathogenitätsfaktoren aufweist. Das Vektorsystem hat ein sehr breites Wirtsspektrum und ist aus diesem Grund universell einsetzbar. Daher sollten zuerst grundlegende Eigenschaften des Vektorsystems charakterisiert werden, anschließend sollte das TET-ON-OFF-System sowie die RNAi-Technologie mit dem Vektorsystem verknüpft werden. Schließlich sollte im Tierversuch unter in vivo Bedingungen ein Gentransfer gezeigt werden. Es konnten grundlegende Eigenschaften wie der zeitliche Ablauf des Gentransfers bestimmt werden. Hierbei konnte die Aufnahme der Viren sowie die daraus resultierende Genexpression in einem zeitlichen Verlauf genau dargestellt werden. Des Weiteren war es möglich, die Stabilität der Genexpression nach der Transduktion sowie die Menge an Integrationen zu bestimmen. Ferner wurde gezeigt, dass es möglich ist, stabile Zelllinien mit rekombinanten AAV herzustellen. Es war sogar möglich, das Tetracyclin-regulierbare System mit dem AAV-Vektorsystem zu kombinieren. Hierbei konnte im TET-OFF-System eine fast 7-fach stärkere Induktion der Luziferase als im TET-ON-System erreicht werden. Das TETON-System zeigte eine 4-fach höhere Basalaktivität im Vergleich zum TET-OFFSystem.Mit dem TET-OFF-System war es auch möglich, das antimikrobielle Peptid hCAP18 herzustellen und immunchemisch nachzuweisen. Wie beim TET-System gelang es gleichermaßen, die RNAi-Technologie mit dem AAV-System zu verbinden, wobei eine Dosis- sowie auch eine Zeit-abhängige Regulation der Luziferaseexpression gezeigt werden konnte. Hierfür wurde eine siRNA gegen Luziferase sowie eine Kontroll-siRNA im Überexpressionsmodell verwendet, wobei die Luziferase um 95 % herunterreguliert werden konnte. Das RNAi-System wurde ebenfalls dazu genutzt, um die IL8-Expression in Epithelzellen nach TNFα-Stimulation durch Reduktion des p65-Proteins zu senken, um somit eine Verringerung des Entzündungsfaktors zu erzielen. Eine verstärkte Expression des hCAP18 sowie seine Sezernierung in das Medium konnte mit zwei verschiedenen rekombinanten AAV-Konstrukten sowohl in HEK-293 Zellen als auch in primären HBE Zellen gezeigt werden. Im Tierversuch wurde ein selbst komplementierendes AAV für den Gentransfer des hCAP18 eingesetzt. Im Modell der regionalen Ischämie in den Kaninchenhinterläufen bestätigten sich die angiogenen Eigenschaften des hCAP18/LL37 nach viralem Gentransfer durch höhere Durchflussgeschwindigkeit und Kapillardichte im behandelten Gewebe.
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author Pinkenburg, Olaf
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contents Summary The vector system based on the adeno-associated virus is a highly attractive system with a low biological security level because of its lack of pathogenic factors. The vector system has a broad tropism and for this reason is a universal tool. A vector system of this kind should first be analysed for its basic properties. After this the TETON- OFF system and RNAi technology should be combined with the viral system. Finally gene transfer should be demonstrated in an in vivo animal model. Basic properties such as the time course of gene transfer were estimated first. Here,it was possible to determine the exact temporal profile of virus uptake and the resulting gene expression in detail. The stability of gene expression after viral transduction and also the amount of integration were also determined. With these recombinant viruses it was also possible to create stabile cell lines.It was possible to combine the tetracycline inducible system with the AAV system. For the TET-OFF system, a seven-fold stronger induction of luciferase could be shown compared to the TET-ON system. The TET-ON system showed a ten-fold higher basal activity than the TET-OFF system. Using the TET-OFF system, it was possible to produce the antimicrobial peptide hCAP18 in HEK-293 cells and to detect it immunochemically. RNAi technology was also combined with the AAV system; there it was possible to show a dose as well as a time-dependent regulation of luciferase expression in HEK-293 cells. In this overexpression model, an siRNA against luciferase and a control siRNA were used. It was possible to downregulate luciferase activity by 95 %. The RNAi technology was also used to reduce IL8 expression after TNFα stimulation of epithelial cells by decreasing the p65 protein. Strong expression of hCAP18, as well as its release into the medium, was shown with two different AAV constructs in HEK-293 cells and also in primary HBE cells. For gene transfer in the animal model, a self-complementing AAV was used. The angiogenic properties of the hCAP18/LL37 were be shown in the chronic ischemic rabbit hindlimb model. After the gene transfer, a higher blood flow and a higher capillary density could be verified in the hindlimb tissue.
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Des Weiteren war es möglich, die Stabilität der Genexpression nach der Transduktion sowie die Menge an Integrationen zu bestimmen. Ferner wurde gezeigt, dass es möglich ist, stabile Zelllinien mit rekombinanten AAV herzustellen. Es war sogar möglich, das Tetracyclin-regulierbare System mit dem AAV-Vektorsystem zu kombinieren. Hierbei konnte im TET-OFF-System eine fast 7-fach stärkere Induktion der Luziferase als im TET-ON-System erreicht werden. Das TETON-System zeigte eine 4-fach höhere Basalaktivität im Vergleich zum TET-OFFSystem.Mit dem TET-OFF-System war es auch möglich, das antimikrobielle Peptid hCAP18 herzustellen und immunchemisch nachzuweisen. Wie beim TET-System gelang es gleichermaßen, die RNAi-Technologie mit dem AAV-System zu verbinden, wobei eine Dosis- sowie auch eine Zeit-abhängige Regulation der Luziferaseexpression gezeigt werden konnte. Hierfür wurde eine siRNA gegen Luziferase sowie eine Kontroll-siRNA im Überexpressionsmodell verwendet, wobei die Luziferase um 95 % herunterreguliert werden konnte. Das RNAi-System wurde ebenfalls dazu genutzt, um die IL8-Expression in Epithelzellen nach TNFα-Stimulation durch Reduktion des p65-Proteins zu senken, um somit eine Verringerung des Entzündungsfaktors zu erzielen. Eine verstärkte Expression des hCAP18 sowie seine Sezernierung in das Medium konnte mit zwei verschiedenen rekombinanten AAV-Konstrukten sowohl in HEK-293 Zellen als auch in primären HBE Zellen gezeigt werden. Im Tierversuch wurde ein selbst komplementierendes AAV für den Gentransfer des hCAP18 eingesetzt. Im Modell der regionalen Ischämie in den Kaninchenhinterläufen bestätigten sich die angiogenen Eigenschaften des hCAP18/LL37 nach viralem Gentransfer durch höhere Durchflussgeschwindigkeit und Kapillardichte im behandelten Gewebe. 2007-10-29 Gentransfer und –regulation mit adeno-assoziierten Virusvektoren 2007 2007-10-02 Pinkenburg et al, J Virol Methods. 2004 Sep;120(1):119-22. Summary The vector system based on the adeno-associated virus is a highly attractive system with a low biological security level because of its lack of pathogenic factors. The vector system has a broad tropism and for this reason is a universal tool. A vector system of this kind should first be analysed for its basic properties. After this the TETON- OFF system and RNAi technology should be combined with the viral system. Finally gene transfer should be demonstrated in an in vivo animal model. Basic properties such as the time course of gene transfer were estimated first. Here,it was possible to determine the exact temporal profile of virus uptake and the resulting gene expression in detail. The stability of gene expression after viral transduction and also the amount of integration were also determined. With these recombinant viruses it was also possible to create stabile cell lines.It was possible to combine the tetracycline inducible system with the AAV system. For the TET-OFF system, a seven-fold stronger induction of luciferase could be shown compared to the TET-ON system. The TET-ON system showed a ten-fold higher basal activity than the TET-OFF system. Using the TET-OFF system, it was possible to produce the antimicrobial peptide hCAP18 in HEK-293 cells and to detect it immunochemically. RNAi technology was also combined with the AAV system; there it was possible to show a dose as well as a time-dependent regulation of luciferase expression in HEK-293 cells. In this overexpression model, an siRNA against luciferase and a control siRNA were used. It was possible to downregulate luciferase activity by 95 %. The RNAi technology was also used to reduce IL8 expression after TNFα stimulation of epithelial cells by decreasing the p65 protein. Strong expression of hCAP18, as well as its release into the medium, was shown with two different AAV constructs in HEK-293 cells and also in primary HBE cells. For gene transfer in the animal model, a self-complementing AAV was used. The angiogenic properties of the hCAP18/LL37 were be shown in the chronic ischemic rabbit hindlimb model. After the gene transfer, a higher blood flow and a higher capillary density could be verified in the hindlimb tissue. 2011-08-10 Philipps-Universität Marburg ths Prof. Dr. Vogelmeier Claus Vogelmeier, Claus (Prof. Dr.) Pinkenburg, Olaf Pinkenburg Olaf
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