Gentargeting des Onkogens HER-2 und des Wachstumsfaktors VEGF über Intronribozyme und Untersuchungen zur HER-2-abhängigen Resistenz gegenüber Taxol und Viscumin

Tumorerkrankungen nehmen in den letzten Jahren einen immer größer werdenden Prozentsatz der Krankheiten in unserer Bevölkerung ein. Krebs ist mit circa 25% die zweithäufigste Todesursache in Deutschland (Statistik des Deutschen Krebsregisters von 2002 – veröffentlicht im Frühjahr 2006). Umso wichtig...

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1. Verfasser: Sander, Martin
Beteiligte: Czubayko, Frank (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2007
Pharmakologie und Toxikologie
Schlagworte:
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topic Vascular endothelial Growth Factor
Onkogen
Medizin, Gesundheit
Genetargeting
Vaskularisation
HER-2
HER-2
Intron-ribozyme
Intronribozyme
Epidermaler Wachstumsfaktor
Taxol
Mistel
Ribozym
Gentargeting
spellingShingle Vascular endothelial Growth Factor
Onkogen
Medizin, Gesundheit
Genetargeting
Vaskularisation
HER-2
HER-2
Intron-ribozyme
Intronribozyme
Epidermaler Wachstumsfaktor
Taxol
Mistel
Ribozym
Gentargeting
Sander, Martin
Cancer is becoming a more and more important disease in our population in the last years. Cancer is the second often cause of death in Germany (statistics of the German cancer register - published in 2006). Even more important becomes the development of new options in the treatment of cancer. The HER-2-receptor is a tyrosinkinasis-receptor. It is an important marker for agressive cancer growth in different tumors and corresponds with an increased potential in metastasis and increased resistance to cytostatic agents. The influence of HER-2 on the chemoresistance of ovarian cancer is controversionally discucced. This dissertation investigates the influence of a reduced level of HER-2 on the proliferation of the ovarian cancer cells SKOV-3 and their chemoresitance to the cytostatic agents Taxol and Viscumin. The HER-2 receptor was inhibited either by specific ribozymes or by the HER-2 antibody Herceptin. Ribozymes are katalytic RNA molecules that specifically cut the target RNA and lead to an inhibition of the protein biosynthesis. It is shown that the proliferation of SKOV-3 cells in adhesion and softagar cultures drops corresponding to the HER-2 level of the cells. An additive effect between ribozymes and Herceptin could not be shown. A reduced level of HER-2 resulted in a reduced chemosensitivity of the cells. An additive effect of ribozymes and Herceptin on the chemosensitivity of ovarian cancer cells could not be observed. Further this dissertation examined the efficiency of intronribozymes. Therefore the expression of the oncogene HER-2 in SKOV-3 ovarian cancer cells and the expression of the growth facotr VEGF in U87 glioblastoma cells was inhibited by specific intronribozymes. In SKOV-3 cells intronribozymes lead to a reduced level of HER-2. This effect was demonstrated in FACS-analysis and ELISA. Likewise intronribozymes were capable of reducing the VEGF expression in U87 glioblastoma cells. This effect was secured by northern blot analysis and ELISA. Using intronribozymes that were inactivated by mutation in the catalytic center resulted in a reduced VEGF protein level without influencing the VEGF RNA level. Intronribozymes showed an equally effective and specific ability as exonribozymes in the inhibition of the protein biosynthesis of a specific protein. Intronribozymes seemed to have an additional antisense effect. This dissertation supplies evidence that intronribozymes are a specific, effective and promising genetargeting strategy. Further this dissertation shows that the proliferation and chemosensitivity of SKOV-3 cells is depending on the HER-2 level. The HER-2 level of SKOV-3 cells could be equally efficiently downregulated by ribozymes and the HER-2 antibody Herceptin.
Gentargeting des Onkogens HER-2 und des Wachstumsfaktors VEGF über Intronribozyme und Untersuchungen zur HER-2-abhängigen Resistenz gegenüber Taxol und Viscumin
description Tumorerkrankungen nehmen in den letzten Jahren einen immer größer werdenden Prozentsatz der Krankheiten in unserer Bevölkerung ein. Krebs ist mit circa 25% die zweithäufigste Todesursache in Deutschland (Statistik des Deutschen Krebsregisters von 2002 – veröffentlicht im Frühjahr 2006). Umso wichtiger ist die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten. Der HER-2-Rezeptor ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor, der bei verschiedenen Tumoren als wichtiger Marker für ein aggressiveres Tumorwachstum, ein erhöhtes Metastasierungs-Potential und eine gesteigerte Chemoresistenz unter der Therapie mit verschiedenen Zytostatika gilt. Über den Einfluss von HER-2 auf die Chemosensitivität von Ovarialkarzinomzellen gibt es widersprüchliche Daten. In dieser Promotionsarbeit wurde untersucht, inwiefern sich eine Verringerung des HER-2 Levels in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen auf die Proliferation der Zellen auswirkt und welche Auswirkungen reduzierte HER-2 Level auf die Behandlung mit den Zytostatika Taxol und Viscumin haben. Der HER-2-Rezeptor wurde in SKOV-3 Zellen entweder durch Ribozyme reduziert oder durch den HER-2 Antikörper Herceptin inhibiert. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, die durch sequenzspezifische Spaltung der Ziel-RNA zu einer Hemmung der Proteinbiosynthese führen. Es zeigte sich, dass die Proliferation der SKOV-3 Zellen sowohl in Adhäsions- als auch in Softagarkulturen mit einer Verringerung des HER-2 Levels sinkt. Ein additver Effekt zwischen Ribozymen und Herceptin konnte festgestellt werden. Ein reduzierter HER-2 Level bewirkte unter der Behandlung mit Taxol oder Viscumin überraschenderweise eine Abnahme - und nicht wie in den meisten Vorstudien eine Zunahme - der Chemosensitivität der Zellen. Wurde der HER-2 Level durch kombinierte Therapie mit Ribozymen und Herceptin vermindert, konnte kein additiver Effekt auf die Chemosensitivitäts-Änderung beobachtet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Effizienz von Ribozymen gegen Intronsequenzen der jeweiligen Zielgene untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen die Expression des HER-2-Rezeptors und in U87 Glioblastomzellen die Expression des tumorrelevanten Wachstumsfaktor VEGF inhibiert. Intronribozyme führten in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen zu einer Verringerung von HER-2, was durch FACS-Analyse und ELISA demonstriert wurde. Gleichfalls konnte die Expression von VEGF in U87 Glioblastomzellen durch Intronribozyme vermindert werden, was durch Daten aus Northern Blot und ELISA belegt wurde. Interessanterweise konnte bei Intronribozymen, deren katalytisches Zentrum durch Mutation inaktiviert worden war, eine Reduktion von VEGF auf Proteinebene, jedoch nicht auf RNA-Ebene, beobachtet werden. Ribozyme gegen Intronsequenzen besitzen somit eine ebenso effektive und präzise Fähigkeit zur Hemmung der Biosynthese eines spezifischen Proteins wie Ribozyme gegen Exonsequenzen, wobei eine zusätzliche Antisense-Wirkung der Intronribozyme anzunehmen ist. Die Untersuchungen dieser Promotionsarbeit ergaben, dass Intronribozyme eine spezifische, effektive und vielversprechende Möglichkeit zum Gentargeting darstellen. Zum anderen wurde gezeigt, dass die Proliferation und Chemosensitivität von SKOV-3 Zellen abhängig von ihrem HER-2 Level ist und Ribozyme hier ähnlich effizient sind wie der HER-2 Antikörper Herceptin.
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contents Cancer is becoming a more and more important disease in our population in the last years. Cancer is the second often cause of death in Germany (statistics of the German cancer register - published in 2006). Even more important becomes the development of new options in the treatment of cancer. The HER-2-receptor is a tyrosinkinasis-receptor. It is an important marker for agressive cancer growth in different tumors and corresponds with an increased potential in metastasis and increased resistance to cytostatic agents. The influence of HER-2 on the chemoresistance of ovarian cancer is controversionally discucced. This dissertation investigates the influence of a reduced level of HER-2 on the proliferation of the ovarian cancer cells SKOV-3 and their chemoresitance to the cytostatic agents Taxol and Viscumin. The HER-2 receptor was inhibited either by specific ribozymes or by the HER-2 antibody Herceptin. Ribozymes are katalytic RNA molecules that specifically cut the target RNA and lead to an inhibition of the protein biosynthesis. It is shown that the proliferation of SKOV-3 cells in adhesion and softagar cultures drops corresponding to the HER-2 level of the cells. An additive effect between ribozymes and Herceptin could not be shown. A reduced level of HER-2 resulted in a reduced chemosensitivity of the cells. An additive effect of ribozymes and Herceptin on the chemosensitivity of ovarian cancer cells could not be observed. Further this dissertation examined the efficiency of intronribozymes. Therefore the expression of the oncogene HER-2 in SKOV-3 ovarian cancer cells and the expression of the growth facotr VEGF in U87 glioblastoma cells was inhibited by specific intronribozymes. In SKOV-3 cells intronribozymes lead to a reduced level of HER-2. This effect was demonstrated in FACS-analysis and ELISA. Likewise intronribozymes were capable of reducing the VEGF expression in U87 glioblastoma cells. This effect was secured by northern blot analysis and ELISA. Using intronribozymes that were inactivated by mutation in the catalytic center resulted in a reduced VEGF protein level without influencing the VEGF RNA level. Intronribozymes showed an equally effective and specific ability as exonribozymes in the inhibition of the protein biosynthesis of a specific protein. Intronribozymes seemed to have an additional antisense effect. This dissertation supplies evidence that intronribozymes are a specific, effective and promising genetargeting strategy. Further this dissertation shows that the proliferation and chemosensitivity of SKOV-3 cells is depending on the HER-2 level. The HER-2 level of SKOV-3 cells could be equally efficiently downregulated by ribozymes and the HER-2 antibody Herceptin.
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In dieser Promotionsarbeit wurde untersucht, inwiefern sich eine Verringerung des HER-2 Levels in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen auf die Proliferation der Zellen auswirkt und welche Auswirkungen reduzierte HER-2 Level auf die Behandlung mit den Zytostatika Taxol und Viscumin haben. Der HER-2-Rezeptor wurde in SKOV-3 Zellen entweder durch Ribozyme reduziert oder durch den HER-2 Antikörper Herceptin inhibiert. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle, die durch sequenzspezifische Spaltung der Ziel-RNA zu einer Hemmung der Proteinbiosynthese führen. Es zeigte sich, dass die Proliferation der SKOV-3 Zellen sowohl in Adhäsions- als auch in Softagarkulturen mit einer Verringerung des HER-2 Levels sinkt. Ein additver Effekt zwischen Ribozymen und Herceptin konnte festgestellt werden. Ein reduzierter HER-2 Level bewirkte unter der Behandlung mit Taxol oder Viscumin überraschenderweise eine Abnahme - und nicht wie in den meisten Vorstudien eine Zunahme - der Chemosensitivität der Zellen. Wurde der HER-2 Level durch kombinierte Therapie mit Ribozymen und Herceptin vermindert, konnte kein additiver Effekt auf die Chemosensitivitäts-Änderung beobachtet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Effizienz von Ribozymen gegen Intronsequenzen der jeweiligen Zielgene untersucht. Hierzu wurde in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen die Expression des HER-2-Rezeptors und in U87 Glioblastomzellen die Expression des tumorrelevanten Wachstumsfaktor VEGF inhibiert. Intronribozyme führten in SKOV-3 Ovarialkarzinomzellen zu einer Verringerung von HER-2, was durch FACS-Analyse und ELISA demonstriert wurde. Gleichfalls konnte die Expression von VEGF in U87 Glioblastomzellen durch Intronribozyme vermindert werden, was durch Daten aus Northern Blot und ELISA belegt wurde. Interessanterweise konnte bei Intronribozymen, deren katalytisches Zentrum durch Mutation inaktiviert worden war, eine Reduktion von VEGF auf Proteinebene, jedoch nicht auf RNA-Ebene, beobachtet werden. Ribozyme gegen Intronsequenzen besitzen somit eine ebenso effektive und präzise Fähigkeit zur Hemmung der Biosynthese eines spezifischen Proteins wie Ribozyme gegen Exonsequenzen, wobei eine zusätzliche Antisense-Wirkung der Intronribozyme anzunehmen ist. Die Untersuchungen dieser Promotionsarbeit ergaben, dass Intronribozyme eine spezifische, effektive und vielversprechende Möglichkeit zum Gentargeting darstellen. Zum anderen wurde gezeigt, dass die Proliferation und Chemosensitivität von SKOV-3 Zellen abhängig von ihrem HER-2 Level ist und Ribozyme hier ähnlich effizient sind wie der HER-2 Antikörper Herceptin. Genetargeting of the oncogene HER-2 and the growth factor VEGF and investigation of the HER-2 dependent resistance to taxol and viscumin 2007 2007-10-29 2011-08-10 opus:1771 2007-09-27 Cancer is becoming a more and more important disease in our population in the last years. Cancer is the second often cause of death in Germany (statistics of the German cancer register - published in 2006). Even more important becomes the development of new options in the treatment of cancer. The HER-2-receptor is a tyrosinkinasis-receptor. It is an important marker for agressive cancer growth in different tumors and corresponds with an increased potential in metastasis and increased resistance to cytostatic agents. The influence of HER-2 on the chemoresistance of ovarian cancer is controversionally discucced. This dissertation investigates the influence of a reduced level of HER-2 on the proliferation of the ovarian cancer cells SKOV-3 and their chemoresitance to the cytostatic agents Taxol and Viscumin. The HER-2 receptor was inhibited either by specific ribozymes or by the HER-2 antibody Herceptin. Ribozymes are katalytic RNA molecules that specifically cut the target RNA and lead to an inhibition of the protein biosynthesis. It is shown that the proliferation of SKOV-3 cells in adhesion and softagar cultures drops corresponding to the HER-2 level of the cells. An additive effect between ribozymes and Herceptin could not be shown. A reduced level of HER-2 resulted in a reduced chemosensitivity of the cells. An additive effect of ribozymes and Herceptin on the chemosensitivity of ovarian cancer cells could not be observed. Further this dissertation examined the efficiency of intronribozymes. Therefore the expression of the oncogene HER-2 in SKOV-3 ovarian cancer cells and the expression of the growth facotr VEGF in U87 glioblastoma cells was inhibited by specific intronribozymes. In SKOV-3 cells intronribozymes lead to a reduced level of HER-2. This effect was demonstrated in FACS-analysis and ELISA. Likewise intronribozymes were capable of reducing the VEGF expression in U87 glioblastoma cells. This effect was secured by northern blot analysis and ELISA. Using intronribozymes that were inactivated by mutation in the catalytic center resulted in a reduced VEGF protein level without influencing the VEGF RNA level. Intronribozymes showed an equally effective and specific ability as exonribozymes in the inhibition of the protein biosynthesis of a specific protein. Intronribozymes seemed to have an additional antisense effect. This dissertation supplies evidence that intronribozymes are a specific, effective and promising genetargeting strategy. Further this dissertation shows that the proliferation and chemosensitivity of SKOV-3 cells is depending on the HER-2 level. The HER-2 level of SKOV-3 cells could be equally efficiently downregulated by ribozymes and the HER-2 antibody Herceptin. 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