Structural and thermodynamic characterization of inhibitor binding to aldose reductase: Insights into binding modes, driving forces and selectivity determinants

The TIM-barrel folded enzyme Aldose reductase (ALR2) is a valuable model system to study structural and thermodynamic features of inhibitor binding and, furthermore, represents an excellent drug target. To prevent diabetic complications derived from enhanced glucose flux via the polyol pathway the d...

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Main Author: Steuber, Holger
Contributors: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2007
Pharmazeutische Chemie
Subjects:
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Table of Contents: Das Enzym Aldose Reduktase (ALR2) stellt ein wertvolles Testsystem dar, um strukturelle und thermodynamische Eigenschaften der Inhibitorbindung zu charakterisieren und ist darüber hinaus ein geeignetes Zielenzym für eine Arzneistoff-Intervention. Zudem ist das Enzym ein hervorragendes Testsystem für Strategien zur Leitstrukturfindung, da es aufgrund der hohen Mobilität der Aminosäure-Reste in der Bindetasche in der Lage ist, verschiedene Konformere einzunehmen und sich ausgesprochen vielseitig an Liganden anzupassen. Zu Beginn dieser Arbeit wird die Strukturbestimmung der Bindungsmoden von durch Virtuelles Screening identifizierten Liganden ergänzt durch Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), um Einblicke in die Triebkräfte des Bindungsprozesses zu erhalten. In Kapitel 3 werden die Kristallstrukturen eines neuartigen Sulfonyl-Pyridazinons im Komplex mit ALR2 beschrieben. Der Inhibitor besetzt mit seiner Pyridazinon-Kopfgruppe die katalytische Tasche, während der chlor-substituierte Benzofuran-Teil die Spezifitätstasche belegt. Die hochaufgelöste Struktur legt nahe, dass die Pyridazinon-Gruppe in deprotoniertem, negativ geladenem Zustand bindet, während das benachbarte Histidin einen ungeladenen Zustand einnimmt. In Kapitel 4 wird die Bindetasche der ALR2 mit einer neuartigen Strukturklasse von Inhibitoren sondiert, um mögliche neue Adaptationsvorgänge des Enzyms sowie den Bindungsmodus der Liganden zu bestimmen und deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu verstehen. Zwei Kristallstrukturen mit einem Liganden der kürzlich veröffentlichten Naphtho[1,2-d]isothiazol-essigsäuren wurden bestimmt. Im Gegensatz zur ursprünglichen Designhypothese zeigt sich die Spezifitätstasche in den Strukturen in geschlossenem Zustand. Der potentere der beiden Liganden erweitert die katalytische Tasche durch Öffnung einer neuen Subtasche. Der zweite Ligand unterscheidet sich vom ersten nur durch einen angefügten Glycolsäure-Teil, mit dem eine der Carboxylgruppen des Liganden verestert ist. Trotz dieser nur geringfügigen Modifikation unterscheidet sich der Bindungsmodus in dramatischer Weise von dem des zuerst untersuchten Liganden. In Kapitel 5 wird der Bindungsprozess von Inhibitoren an ALR2 im Hinblick auf Änderungen von Protonierungszuständen untersucht. Die durchgeführten ITC-Messungen legen eine Protonenaufnahme bei der Bindung von Liganden des Carbonsäure-Typs nahe. Zur weiteren Interpretation werden in diesem Kapitel pKa-rechnungen zusammen mit ortsspezifischer Mutagenese und thermodynamischen Messungen eingesetzt. Diese lassen ein in der katalytischen Tasche befindliches Tyrosin (Tyr 48) für die Protonenaufnahme bei der Ligandbindung als wahrscheinlich erscheinen, da diese Seitenkette im NADP+-gebundenen Zustand zu bemerkenswertem Ausmaß deprotoniert vorliegt. In diesem Zusammenhang wird die Bindung von IDD 388, IDD 393, Tolrestat, Sorbinil und Fidarestat diskutiert. In Kapitel 6 werden selektivitätsbestimmende Eigenschaften identifiziert, die die Bindung von Liganden an ALR2 energetisch günstiger erscheinen lassen als an die konkurrierende Isoform Aldehyd Reduktase (ALR1). Die zu diesem Zweck erstellten mutierten ALR2-Konstrukte wurden mit Hilfe von Kristallstrukturbestimmung und ITC auf ihre Einflussnahme bezüglich der Ligandenselektivität untersucht. Dazu diente ein Ligandensatz, der aus Zopolrestat, einem verwandten Uracil-Derivat, IDD 388, IDD 393, Sorbinil, Fidarestat und Tolrestat zusammengestellt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von Anpassungsvorgängen in der mutierten Bindetasche essentiell für die Einpassung der Liganden ist. Dieses lässt Rückschlüsse auf das Selektivitätsverhalten der Liganden zu. In vielen Fällen ist die Kristallstrukturbestimmung als schlussendlicher Beleg für die spezifische Wechselwirkung des Liganden mit dem Zielmolekül angesehen, da sie das genaue Wechselwirkungsmuster beider Bindungspartner repräsentiert. Diese weit verbreitete Vorgehensweise beruht auf der Annahme, dass eine Kristallstruktur eines gegebenen Protein-Ligand-Komplexes einzigartig und unabhängig von dem Protokoll ist, die zur Erzeugung der komplexierten Kristalle diente. In Kapitel 7 werden zwei Beispiele diskutiert, die zeigen, dass diese Annahmen nicht allgemein gültig sind.