Untersuchungen zur Modulation der Ionenleitfähigkeit von P2X3-und P2X7-Rezeptoren durch extrazelluläre Phosphorylierung und Regulation der Rezeptorexpression in HEK 293-Zellen

In der vorliegenden Arbeit wurden an zwei Typen von ionotropen ATP-empfindlichen P2X-Rezeptoren (P2X3, P2X7) Experimente zu den folgenden zwei Fragestellungen durchgeführt. A. Regulation der Ionenleitfähigkeit des P2X3-Rezeptors durch Phosphorylierung einzelner Aminosäuren der extrazellulären Sch...

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Main Author: Stanchev, Doychin Toshev
Contributors: Krieglstein, Josef (Prof. Dr. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2007
Pharmakologie und Toxikologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:In der vorliegenden Arbeit wurden an zwei Typen von ionotropen ATP-empfindlichen P2X-Rezeptoren (P2X3, P2X7) Experimente zu den folgenden zwei Fragestellungen durchgeführt. A. Regulation der Ionenleitfähigkeit des P2X3-Rezeptors durch Phosphorylierung einzelner Aminosäuren der extrazellulären Schleife 1. Nukleotide wie UTP, GTP und ATP steigerten den ,-meATP-induzierten Strom an mit humanen P2X3-Rezeptoren transfizierten HEK293-Zellen und an nativen P2X3-Rezeptoren von Hinterwurzelganglienzellen (DRG-Neurone) der Ratte. Allerdings musste die Interaktion zwischen den endogenen P2Y- und P2X-Rezeptoren durch die Blockade von G-Proteinen mittels intrazellulärem GDP--S unterbunden werden, um den potenzierenden Effekt der Nukleotide beobachten zu können. 2. Der Nukleotid-Effekt entwickelte sich konzentrations- und zeitabhängig. Der lange Zeitabstand zwischen Nukleotid-Applikation und maximaler Wirkung (Minutenbereich) lässt die Vermutung zu, dass es sich weder um ionotrope (Millisekundenbereich) noch um klassische G-Protein-vermittelte (Sekundenbereich) Effekte handelt. 3. Deshalb haben wir angenommen, dass eine Übertragung der terminalen Phosphatreste der Nukleotide auf Konsensus-Phosphorylierungsstellen der extrazellulären Schleife des hP2X3-Rezeptors die Grundlage für den beobachteten Effekt sein könnte. Anhand einer Computer-Modellierung kommen Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen als Zielorte in Frage. Tatsächlich konnten PKC-Aktivatoren (DAG-Lakton, PMA) eine dem UTP ähnliche Steigerung der ,-meATP-induzierten-Ströme auslösen. Die Wirkung der PKC-Aktivatoren und die des UTP konnten gleichermaßen durch PKC-Inhibitoren (Staurosporin, Gö 6976, PKC-inhibitorisches Peptid, K252b) aufgehoben werden. Da weder UTP noch das PKC-inhibitorische Peptid oder K252b in das Zellinnere diffundieren, scheint erwiesen zu sein, dass die Phosphorylierung an extrazellulären PKC-Stellen des P2X3-Rezeptors entsteht. 4. P2X3-Rezeptormutanten, in deren Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen (PKC-2 und -3; nicht aber PKC-4 und -6); die relevanten Ser- oder Thr-Reste durch Ala ersetzt wurden, reagierten nicht mehr auf die Applikation von UTP mit einer Erhöhung der ,-meATP-induzierten Ströme. Die Stromamplituden der Mutanten waren kleiner als die des Wild-Typ-Rezeptors, die Desensibilisierungskinetik war jedoch nicht wesentlich verändert. Hingegen führte die Substitution von Ser oder Thr in allen vier Ekto-PKC-Phosphorylierungsstellen durch Asp zu einer signifikanten Verlangsamung der Stromantworten und einer Hemmung ihrer Amplituden. Darüber hinaus entfiel die Wirkung von ,-meATP vollständig. 5. Die Potenzierung der ,-meATP-induzierten Ströme durch UTP und geringe Konzentrationen von ATP konnte an DRG-Neuronen der Ratte ebenfalls nachgewiesen werden. Dieser Effekt wurde durch PKC-Hemmer verhindert. B. Regulation der Ionenleitfähigkeit des P2X7-Rezeptors durch eine vermehrte Expression des Rezeptorproteins in der Zellmembran nach ischämischen Stimuli 1. Es wurden EGFP-gekoppelte P2X7-Rezeptoren und zwei Mutanten hergestellt. Diese Mutanten (E496A, I568N) weisen ein unvollständiges Traffickingverhalten und demzufolge einen reduzierten Einbau in die Zellmembran auf bzw. werden infolge der nicht-optimalen Assemblierung der Untereinheiten nicht zum funktionsfähigen Rezeptor zusammengebaut. 2. Elektrophysiologische und Dye-Uptake- (Propidium Iodid-Aufnahme) Experimente belegten die Funktionsfähigkeit des Wildtyp-Rezeptors und die fehlende Funktionalität der beiden Mutanten. 3. Eine in vitro Ischämie erzeugte ein vermehrtes Erscheinen des Wild-Typ-Rezeptors in der Zellmembran; die funktionsuntüchtigen Mutanten wurden jedoch unverändert nur in geringem Maße an dieser Stelle exprimiert. Diese Aussage konnte durch immunhistochemische Experimente mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie belegt werden. Elektrophysiologische Experimente bestätigten, dass ein vermehrtes Erscheinen des P2X7-Rezeptors in der Zellmembran nach Ischämie mit höheren Amplituden der ,-meATP-induzierten Ströme einhergeht. C. Nukleotid- und Ischämie-bedingte Potenzierung ionotroper P2X-Rezeptorströme Exemplarisch wurde an zwei prototypischen P2X (P2X3 und P2X7)-Rezeptoren gezeigt, dass gewebsschädigende Vorgänge (z.B. Schmerz oder Ischämie) über eine vermehrte Nukleotidabgabe in den Extrazellulärraum bzw. durch z.Z. unbekannte Transduktionswege die Funktion der o.g. Rezeptoren steigern können. Die jeweiligen Mechanismen sind die Phosphorylierung von Ekto-PKC-Stellen und ein erhöhtes Erscheinen des Rezeptors in der Zellmembran (Förderung des Einbaus in die Membran oder Hemmung der Aufnahme in das Zellinnere).
DOI:https://doi.org/10.17192/z2007.0109