Untersuchungen zur Biogenese von Eisen-Schwefel Proteinen und zur Eisenhomeostase am Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae

Eisen-Schwefel- (Fe/S) Cluster sind anorganische Cofaktoren zahlreicher Proteine und ubiquitär in allen Organismen zu finden. Fe/S Proteine übernehmen wichtige Aufgaben beim Elektronentransport, in der Genregulation und in Enzymkatalysen. In Eukaryoten wird die Reifung dieser Proteine von drei kompl...

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Main Author: Hausmann, Anja
Contributors: Lill, Roland (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2006
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Eisen-Schwefel- (Fe/S) Cluster sind anorganische Cofaktoren zahlreicher Proteine und ubiquitär in allen Organismen zu finden. Fe/S Proteine übernehmen wichtige Aufgaben beim Elektronentransport, in der Genregulation und in Enzymkatalysen. In Eukaryoten wird die Reifung dieser Proteine von drei komplexen Maschinerien übernommen. Die in der mitochondrialen Matrix lokalisierte ISC- (iron-sulfur cluster) Assemblierungsmaschinerie ist an der Reifung aller zellulären Fe/S Proteine beteiligt. Demgegenüber übernehmen die mitochondriale ISC-Export- und die cytosolische CIA- (cytosolic iron-sulfur protein assembly) Maschinerie eine spezifische Funktion in der Reifung extra-mitochondrialer Fe/S Proteine. In den letzten vier Jahren wurden insgesamt sechs Proteine der CIA-Maschinerie identifiziert. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte die essentielle P Loop NTPase Nbp35 aus Saccharomyces cerevisiae als Komponente der CIA-Maschinerie nachgewiesen werden. Die Depletion von Nbp35, durch regulierte Genexpression, führte zur verminderten Aktivität des cytosolischen Fe/S Proteins Isopropylmalat-Isomerase (Leu1). Demgegenüber wurden mitochondriale Fe/S Proteine nicht beeinflusst. Starke Defekte in der de novo Reifung von extra-mitochondrialen Fe/S Proteinen belegten die spezifische Beteiligung von Nbp35 an der Biogenese dieser Fe/S Proteine. Nbp35 bindet am N-Terminus selbst einen Fe/S Cluster, zu dessen Assemblierung die ISC- und CIA Maschinerien benötigt werden. Die gestörte Biogenese von Fe/S Proteinen hat eine erhöhte Eisenakkumulation in den Mitochondrien sowie die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Aft1/Aft2, den Hauptregulatoren der Eisenhomeostase in Hefe zur Folge. Diese Auswirkungen sind spezifisch auf Defekte in den beiden mitochondrialen ISC-Maschinerien zurückzuführen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden deshalb die genom-weiten Auswirkungen von Depletionen der drei Fe/S Protein-Assemblierungsmaschinerien durch Transkriptom-Analysen untersucht, um vergleichende Einblicke in die Konsequenzen funktioneller Defekte der Fe/S Protein-Biogenese zu erhalten. Dazu wurden Hefe-Mutanten verwendet, in denen das Ferredoxin Yah1 (ISC Assemblierung), der ABC-Transporter Atm1 (ISC-Export) oder Nbp35 (CIA) als repräsentative Mitglieder der drei Biogenese-Maschinerien depletiert wurden. Die Transkriptionsprofile Nbp35-depletierter Zellen zeigten nur wenige differentiell exprimierte Gene. Keines dieser Gene weist auf eine Verbindung zur Eisenhomeostase hin. Demzufolge übt die CIA-Maschinerie überraschenderweise keinen Einfluss auf die Eisenhomeostase aus. Somit wurde eine frühere Hypothese widerlegt, nach der die Eisenhomeostase über ein cytosolisches Fe/S Protein vermittelt wird. Die Depletion von Atm1 und Yah1 ist dagegen mit einer umfassenden sowie weitgehend überlappenden Änderung des Genexpressionsmusters verbunden, welches u.a. die Induktion Aft1/Aft2-abhängiger Gene und die Reprimierung von Genen, die für Komponenten der mitochondrialen Atmungskette kodieren, beinhaltet. Weitere transkriptionelle Veränderungen betrafen die Ergosterol- und Biotin-Synthese, den Aminosäurestoffwechsel sowie Gene, die für Proteine der Synthese oder des Abbaus von Häm oder für Häm-haltige Proteine kodieren. Insgesamt ähneln die Transkriptionsprofile Atm1- und Yah1-depletierter Zellen dem einer Eisen-depletierten Zelle. Unterstützt wurden diese Beobachtungen durch Promotoranalysen und Northern Blots an ausgewählten Eisen-abhängigen Genen [z.B. ERG3 (Ergosterol-Biosynthese), BIO2 (Biotin-Synthese) und HEM15 (Häm-Biosynthese)]. Demnach signalisiert die Depletion von Yah1 und Atm1 und damit die reduzierte Synthese von zellulären Fe/S Proteinen offensichtlich der Zelle einen Eisenmangel. Die Daten legen nahe, dass die Mitochondrien als Orte der Fe/S Cluster- und Häm-Biogenese entscheidend an der Regulation der zellulären Eisenhomeostase beteiligt sind. Interessanterweise besitzt die Häm-Biosynthese in Hefe keinen vergleichbaren Einfluss auf die Eisenhomeostase. Nach einer vorläufigen Modellvorstellung könnte die ISC-Assemblierungs- und Exportmaschinerie an der Synthese und dem Export einer (noch unbekannten) Komponente beteiligt sein, die neben einer Funktion in der Reifung extra-mitochondrialer Fe/S Proteine auch an der Inhibierung von Aft1 als Transkriptionsaktivator beteiligt ist. Zusätzlich könnte diese Komponente weitere Stoffwechselwege (z.B. Respiration, Häm-Synthese), in denen Eisen benötigt wird, regulieren. Bereits aus früheren Arbeiten war bekannt, dass ein Funktionsverlust der mitochondrialen ISC-Maschinerien zusätzlich mit einem Häm-Defekt einhergeht, der den Aktivitätsverlust Häm-haltiger Proteine in Yah1- und Atm1-depletierten Zellen erklärt. Der Häm-Mangel basiert zum einen auf der reversiblen Inhibierung der Ferrochelatase (Hem15p). In dieser Arbeit konnte des Weiteren gezeigt werden, dass das HEM15 Gen in Yah1-, Atm1- sowie in Eisen-depletierten Zellen transkriptionell reprimiert wird.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2007.0063