Charakterisierung kleiner G-Proteine der Ras- und Rho/Rac-Familie in Ustilago maydis: Zentrale Schalter in komplexen Netzwerken und ihr Einfluss auf die Organisation der Zellmorphologie

Kleine G-Proteine haben in eukaryotischen Zellen vielfältige regulatorische Aufgaben. Sie wirken als molekulare Schalter, die im GTP-gebundenen Zustand aktiv, im GDP-gebundenen Zustand hingegen inaktiv sind. Im GTP-gebundenen Zustand sind sie in der Lage, mit Effektoren zu interagieren und diese zu...

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Main Author: Mahlert, Michael
Contributors: Bölker, Michael (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2006
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Kleine G-Proteine haben in eukaryotischen Zellen vielfältige regulatorische Aufgaben. Sie wirken als molekulare Schalter, die im GTP-gebundenen Zustand aktiv, im GDP-gebundenen Zustand hingegen inaktiv sind. Im GTP-gebundenen Zustand sind sie in der Lage, mit Effektoren zu interagieren und diese zu aktivieren. Kleine G-Proteine sind an sehr verschiedenen Prozessen, wie der Regulation der Genexpression und der Zellproliferation, der Organisation des Zytoskeletts und des Vesikelverkehrs beteiligt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen G-Proteinen der Rho/Rac- und der Ras-Familie im phytopathogenen Basidiomyceten Ustilago maydis. Dieser Pilz eignet sich aufgrund seiner dimorphen Lebensweise gut als Modellorganismus, um die Regulation der Zellmorphologie zu untersuchen. Kleinen G-Proteinen der Rho/Rac-Familie wird hauptsächlich die Organisation des Aktin-Zytoskeletts zugeschrieben, weshalb der Einfluss dieser Proteine auf die Zellmorphologie groß ist. In U. maydis führt das Ausschalten des Rho/Rac-Proteins Cdc42 anders als in Saccharomyces cerevisiae nicht zur Letalität, sondern lediglich zu einem Defekt in der Zellseparation und zu Paarungsdefekten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Ausschalten des nahe verwandten Proteins Rac1 zu Defekten in der Knospenbildung und im filamentösen Wachstum führt. Trotz der defekten Knospenbildung sind rac1-Deletionsmutanten aber lebensfähig und teilen sich durch Abschnürung an einem zentralen Septum. Überexpression von rac1 führt zu filamentösem Wachstum, während rac1-Deletionsmutanten nicht zur Filamentbildung der Lage sind. Das zeigt, dass Rac1 notwendig und hinreichend für das Umschalten des Wachstumsmusters in U. maydis ist. Die Expression einer konstitutiv aktiven Version von Rac1 führt zu starker Vakuolisierung und zum Aufblähen der Zellen sowie zum Zellzyklusarrest. Durch die Analyse einer Doppelmutante von cdc42 und rac1 konnten außerdem redundante Funktionen der beiden Proteine in der Regulation der Vesikelfusion aufgedeckt werden. Dies erklärt auch die Lebensfähigkeit von U. maydis in Abwesenheit von Cdc42. Die Analyse von Ras1 ergab, dass es sich hierbei um ein essentielles Protein handelt. In Abwesenheit von Ras1 bilden sich Cluster von großen, kugelrunden und einfach septierten Zellen, die Defekte in der Kernverteilung aufweisen. Der morphologische Phänotyp ähnelt dem einer cdc42/rac1-Doppelmutante. Auch in der Vakuolenfusion treten hier ähnliche Defekte auf. Eine Epistasis-Analyse ergab, dass Ras1 die Vakuolenfusion über die Aktivierung von Rac1 steuert, und gibt einen Hinweis auf die regulatorische Vernetzung der kleinen G-Proteine. Die Überexpression des Wildtypallels von ras1 führt zu Filamentbildung. Dieses Signal wird unabhängig von Rac1 vermittelt, allerdings sind die Filamente in Abwesenheit von Rac1 deutlich dicker. Die Expression einer konstitutiv aktiven Version von ras1 führt nicht zur Filamentbildung, was zeigt, dass hierfür ein intakter GTPase-Zyklus des Proteins wichtig ist. Sehr starke Expression der konstitutiv aktiven Version führt zu einer starken Hyperseptierung der Zellen. Dieser morphologische Phänotyp stellt sich bei sehr starker Expression der wildtypischen Version in abgeschwächter Form ebenfalls ein. Desweiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ras1, anders als bisher vermutet, auch die MAPK-Kaskade aktivieren kann. Die starke Überexpression der konstitutiv aktiven Version führt zu sehr starker Aktivierung dieses Signalweges. Die MAPK-Kaskade kann in U. maydis also von beiden Ras-Proteinen aktiviert werden. Der cAMP-Signalweg hingegen kann von Ras1, nicht aber von Ras2 aktiviert werden. Durch die Analyse der Expression von ras1 und ras2 bei konstitutiver Aktivität bzw. Inaktivität des cAMP-Signalweges bzw. der MAPK-Kaskade konnte ein Modell aufgestellt werden, nach dem der cAMP-Signalweg die Aktivität der MAPK-Kaskade über die Expression von Ras2 beeinflussen kann.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2006.0915