Privilegierte Strukturen zur Inhibitionvon Serinproteasen – Docking und direktes Design in der Proteinbindetasche

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Ansätze zur Erstellung von Ligandbibliotheken untersucht. Als etablierte Modelle dienten dabei die Serinproteasen Thrombin und FaktorXa. Zunächst wurde mit einer Serie von vier Inhibitoren der Serinprotease Thrombin die verwendeten Methoden validiert....

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Gerlach, Christof
Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2006
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Zusammenfassung:In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Ansätze zur Erstellung von Ligandbibliotheken untersucht. Als etablierte Modelle dienten dabei die Serinproteasen Thrombin und FaktorXa. Zunächst wurde mit einer Serie von vier Inhibitoren der Serinprotease Thrombin die verwendeten Methoden validiert. Im Bereich des computergestützten Molekular Design kamen Docking, Scoring und Minimierungstechniken zum Einsatz. Hierbei wurden zunächst die Bindungsgeometrien der vier Vertreter in der Bindetasche von Thrombin modelliert. Im Anschluss daran wurde enzymatische Kinetikassays zur Bestimmung der Bindungskonstante durchgeführt. Zusätzlich zur genaueren Beschreibung der thermodynamischen Kenngrößen Enthalpie (ΔH) und Entropie (-TΔS) wurden Isothermale Kalorimetrie (ITC) Messungen angewendet. Hierbei stellte sich für zwei Vertreter der Serie unterschiedliches Verhalten bei gleicher freier Energie (ΔG) heraus. Die beide Liganden unterscheiden sich in der Größe eines substituierten aliphatischen Ringes (fünf- und sechsgliedrig). Durch das Vorhandensein einer zusätzlichen Methylengruppe ergibt sich ein stärker Entropie-getriebenes Bindungsverhalten. Mit Hilfe der Röntgenstruktur-Kristallographie wurden die Bindungsgeometrien der beiden Liganden in Komplex mit Thrombin bestimmt. Für den fünfgliedrigen Ring wurde eine gut-definierte Differenz-Elektronendichte innerhalb der S3/S4 Spezifitätstasche beobachtet. Für den Bereich des sechsgliedrigen Ringes konnte jedoch keine Bindungsgeometrie für den Cycloheyan-Ring gefunden werden. Hier zeigte sich keine klare Differenz-Elektronendichte, die zur Lage des Ringes verwendet werden konnte. Demzufolge ist eine höhere Flexibilität des Ringes zu vermuten, welches im Einklang mit den vorgestellten ITC ist. Zusätzlich wurden zur Detektion der Ligandflexibilität Molekular Dynamik (MD) Simulationen durchgeführt. Durch die Validierung der Methoden konnten Beiträge von Protein-Ligand Wechselwirkungen beobachtet werden, die zur weiteren Generierung von vier Ligandserien zur Erweiterung der Bibliothek von Serinproteaseinhibitoren berücksichtigt wurden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene Methoden zur virtuellen Generierung von Ligandbibliotheken untersucht. Als erstes wurde ein Verfahren entwickelt, dass aus ähnlichen Subtaschen, Bausteine für kombinatorische Bibliotheken ableitet. Durch die virtuelle Erstellung und Bewertung der Bibliothek, konnten Erfolg versprechende Vertreter ausgewählt werden. Durch die anschließende Synthese und experimentelle Testung der Substanzen konnten Inhibitoren für die Serinprotease Thrombin im micromolaren Bereich erhalten werden. Weiterhin wurden zwei etablierte Verfahren des Virtuellen Screenings (flexible dreidimensionale Pharmakophorsuchen und Protein-Ligand Docking) miteinander verglichen. Dabei wurde der Einfluss von der Art und Weise der Beschreibung von Rezeptorinformation auf die Qualität der Filterergebnisse der beiden Verfahren untersucht. Eine Prozedur zur Erstellung von Pharmakophoren aus Proteininformation wurde mit Hilfe der Programme FTrees und DrugScoreCSD entwickelt. Durch die Umwandlung von günstigen Wechselwirkungsfeldern in so genannte „HotSpot“-Kugeln konnten FTrees aus der Proteininformation erstellt werden. Die entwickelte Methode dient einerseits zur Durchführung von Ähnlichkeitssuchen für Proteine, wo nur wenige Liganden bekannt sind, aber auch zu Erweiterung von ligandbasierten FTrees für Bereiche von Bindetaschen, die bisher noch nicht von bekannten Liganden adressiert werden.