The surfactin biosynthetic complex of Bacillus subtilis: COM domain-mediated biocombinatorial synthesis, and single step purification of native multi-modular NRPSs and multi-enzyme complexes

Most biosynthetic templates for the assembly of peptide natural products are composed of two or more nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). For example, the surfactin biosynthetic complex consists of three NRPSs (SrfA-A, SrfA-B, and SrfA-C), which are encoded by the polycistronic srfA operon with...

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Main Author: Chiocchini, Claudia
Contributors: Buckel, Wolfgang (Prof.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:English
Published: Philipps-Universität Marburg 2006
Biologie
Subjects:
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Table of Contents: Die meisten Biosynthese-Matrizen von Peptid-Naturstoffen sind aus mehreren nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) aufgebaut. Der Biosynthese-Komplex des Lipopeptid-Antibiokums Surfactin z.B. besteht aus drei NRPSs (SrfA-A, SrfA-B und SrfA-C), welche vom polycistronischen srfA Operon des Produzentenstammes B. subtilis kodiert werden. Aufgrund der molekularen Logik der nichtribosomalen Peptidsynthese erfordert die Biosynthese eines definierten Produktes eine ausschließliche Interaktion von Partner-Enzymen (z.B. SrfA-A/SrfA-B und SrfA-B/SrfA-C). Anhand von in vitro Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese selektiven Wechselwirkungen von Kommunikations-vermittelnden (communication-mediating, COM) Domänen kontrolliert werden, welche am C- bzw. N-Terminus der entsprechenden Donor- oder Akzeptor-Enzyme lokalisiert sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden das Potential von COM-Domänen zur Umpro-grammierung des Surfactin-Biosynthese-Komplexes, sowie zur Generierung eines in vivo Systems zur biokombinatorischen Synthese von Lipopeptiden ausgenutzt. Hierfür wurde das erste COM-Domänenpaar (zw. SrfA-A und SrfA-B), gegen unterschiedliche verwandte, mis-verwandte und nicht-verwandte COM-Domänenpaare ausgetauscht. Die Auswirkungen dieser Manipulationen wurden anschließend mittels HPLC und MS analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass COM-Domänenpaare des Tyrocidine-Biosynthese-Komplexes auch im heterologen Wirt und NRPS-System ihre uneingeschränkte Funktionalität und Selektivität bewahren. Des weiteren konnte durch die Verwendung eines nicht-verwandten COM-Domänenpaares die tri-modulare Peptidsynthetase SrfA-B gezielt übersprungen und eine produktive Interaktion zwischen den nativen Nicht-Partner-Enzymen SrfA-A und SrfA-C etabliert werden. Dieses Übergehen von SrfA-B führte zur Bildung eines verkürzten Lipotetrapetid-Produktes. In einem weiteren Test wurden alle Donor- und Akzeptor-Enzyme mit demselben cognaten COM-Domänenpaar ausgestattet. Die hiermit verbundene Aufhebung der Selektivitätsbarriere führte zur Etablierung eines universellen Kommunikationssystems (universal communication system, UCS), sowie zur gleichzeitigen, biokombinatorische Synthese von zwei Lipopeptid-Produkten. All diese Ergebnisse verifizierten die entscheidende Bedeutung von COM-Domänen für die Kontrolle der Protein-Protein-Kommunikation zwischen NRPSs erstmals in vivo und im Kontext eines natürlichen NRP-Montagebandes. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine schonende Methode zur Reinigung von NRPSs und multi-enzymatischen NRPS-Biosynthese-Komplexen entwickelt. Grundlage hierfür bildete die Verwendung von polyol-responsiven monoklonalen Antikörpern (PR-mAk), welche in der Lage sind ihr Antigen unter schonenden, nicht-denaturierenden Bedingun-gen – in Anwesenheit von Polyolen – freizusetzen. Diese Antikörper wurden erstmals für die Reinigung des E. coli RNA-Polymerase-Komplexes samt der locker gebundenen -Faktoren verwendet, was u.a. zur Identifizierung des Antigen/Antikörper-Paares Epitop/NT73 führte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der codierende Bereich dieses Epitops an das 3’-Ende des srfA-A Gens fusioniert. Anschließend konnte das kodierte Protein SrfA-A-epi aus Rohextrakten des entsprechenden B. subtilis-Stammes mittels Immunoaffinitäts-Chromatographie gereinigt werden. SDS-PAGE und MS/MS Analysen, sowie biochemische Charakterisierungen verifizierten hierbei die Reinigung von SrfA-A-epi in aktiver holo-Form, sowie im Komplex mit seinem natürlichen Partner-Enzym SrfA-B (Molekularmasse des dimeren Komplexes: ca. 803 kDa).