Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding

Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen gross...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Czodrowski, Paul
Beteiligte: Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2006
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
title Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
spellingShingle Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
pKa Werte
Drug design
Electrostatik
Medizin, Gesundheit
Protonatierungszustände
Electrostatics
Protein-Ligand Komplexe
Drug Design
Protein-ligand complexes
pKa values
Protonation states
Recent hardware development increase the computing power, in consequence many biological and chemical processes can now be successfully modelled in a way which was not to imagine 20 years ago. Examples of such processes are molecular dynamics studies of large biomolecules, the prediction of free energy of binding for protein-ligand complexes, investigations of reaction paths in enzymes, to mention only a few. One issue which is still unresolved concerns the accurate estimation of protonation states in protein-ligand complexes. In this thesis, we present the development of a novel charge assignment procedure named PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimized for Poisson-Boltzmann calculations), which represents a method for the assignment of atomic partial charges. It works reliably with both proteins and small organic molecules using a consistent approach. Such charges are a key parameter in Poisson-Boltzmann (PB) calculations, which are a well-established method for pKa calculations of proteins. The development of the PEOE PB charges is necessary, because no generic procedure exists to perform PB-based pKa calculations of protein-ligand complexes. The development of the PEOE PB charges is described in section 2. We adapted the PEOE formalism to optimally predict solvation free energies of small organic molecules. Modifications were performed in a heuristic manner, i.e. purely result-oriented. The changes considered exclusively parameter a of the PEOE polynomial (see section 2.2.1). In our optimization protocol, we first attempted to reproduce best solvation free energies of the polar amino acids (r2 is 0.94, RMSD is 0.84) and continued with a dataset of 80 small organic molecules (r2 is 0.78, RMSD is 1.57). The latter step underlines the generic character of our PEOE PB charges. Subsequently, we performed calculations on a dataset of nine (apo) proteins with 132 experimentally determined pKa values and obtained an overall RMSD of 0.88. The dielectric constant of the protein is set to 20. Active site residues with highly shifted pKa values are given for two enzymes of the dataset. For these, the following issues were indicated: * The value of the dielectric constant has to be lowered from 20 to 4, which can be partially explained by the degree of burial of the binding pocket. * The orientation of the tyrosine OH group was observed to have a remarkable influence on the pKa value of an active site residue (a glutamate with a highly increased pKa value). This fact emphasizes that the position of polar hydrogens can be crucial. In the final step of our PEOE PB validation study, we performed pKa calculations for three protein-ligand complexes, where experiment revealed a proton transfer. All our calculations agree with the experimental findings. In section 3, we describe pKa calculations for a series of ligands binding to the serine proteases trypsin and thrombin. For the studied complexes, we previously performed an extensive ITC and crystallographic study and were able to identify protonation changes for four complexes [22]. However, since ITC measures only the overall proton exchange, it does not provide structural insights into the functional groups involved in the proton transfer. By using Poisson-Boltzmann calculations based on our PEOE PB charges, we compute pKa values for all complexes from our previous work in order to reveal the residues with altered protonation states. The results indicate that His57, a member of the catalytic triad, is responsible for the most relevant pKa shifts resulting in the experimentally detected protonation changes. This ®nding is in contrast to our previous assumption that the observed protonation changes occur at the carboxylic group of the ligands. The newly detected proton acceptor is used for a revised factorization of the ITC data, which is necessary in cases where the protonation inventory changes upon complexation. pKa values of complexes showing no change of protonation in the ITC experiment are reliably predicted in most cases, whereas predictions of strongly coupled systems remain problematic. Such coupled systems appear if two (or more) strongly interacting titratable groups are close to each other. The HIV protease (HIVP) is a prominent example of successful structure-based drug design, and it is a well-studied system for which, as experimental evidence shows, protonation changes in the active site occur upon ligand binding (section 4). In the apo enzyme, the catalytic dyad consisting of two aspartates is in the mono-protonated state. This protonation state can be altered by ligands bearing a cyclic urea moiety. Our PEOE PB charge model reliably suggests the experimentally determined protonation states in the active site of HIVP. Furthermore, we perform pKa calculations for two HIVP complexes with novel types of inhibitors developed and synthesized in our group [115, 114]. For these complexes, no experimental knowledge on the protonation states is given. For one of the compounds, containing a central pyrrolidine ring, the calculations predict that both catalytic aspartates should be deprotonated upon ligand binding (Table 4.12 and 4.13). Such a protonation pattern has yet not been observed in any HIVP complex. Similarly to the experimental trypsin/thrombin study, a combined crystallographic and thermodynamic investigation of the ligand complexation process of human aldose reductase (hAR) was performed in our group [23]. The ITC measurements detected a proton transfer induced by the ligand binding process. Our calculations suggest an active site tyrosine residue (Tyr48) as proton acceptor, which is equivalent to a deprotonated tyrosine in the holo enzyme. This is in agreement with the ITC results for the Tyr48Phe mutant. Good quantitative agreement with the ITC experiment is obtained for the hAR complexes with inhibitors bearing a carboxylic head group. In contrast, the calculations cannot reliably predict the properties of inhibitors with a cyclic hydantoin moiety. A possible explanation for the de®ciency is the fact that the ligand shows a strong electrostatic interaction with the active site tyrosine and lysine residues. Furthermore, its pKa value in aqueous solutions falls next tothe physiological pH range which makes the system very sensitive to the actual pKa shifts. One limiting factor for the large-scale application of the pKa calculation methodology presented here concerns the ligand processing. For this purpose, we included the PEOE_PB algorithm in the PDB2PQR program. This tool serves as the input file generator for the Poisson-Boltzmann solver APBS. Besides the fully flexible ligand consideration within the PDB2PQR framework, substructure matching has been enabled for the ligand. With this technique, it is possible to automatically detect titratable groups of the ligand and assign pKa values. These pKa values originate from a database which has designed built and currently contains 348 molecules with experimentally determined pKa values.
Czodrowski, Paul
title_short Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
title_full Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
title_fullStr Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
title_full_unstemmed Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
title_sort Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
license_str http://archiv.ub.uni-marburg.de/adm/urhg.html
oai_set_str_mv open_access
ddc:610
doc-type:doctoralThesis
xMetaDissPlus
url http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0801/pdf/dpc.pdf
author2 Klebe, Gerhard (Prof. Dr.)
author2_role ths
topic pKa Werte
Drug design
Electrostatik
Medizin, Gesundheit
Protonatierungszustände
Electrostatics
Protein-Ligand Komplexe
Drug Design
Protein-ligand complexes
pKa values
Protonation states
dewey-raw 610
dewey-search 610
genre Medical sciences, Medicine
genre_facet Medical sciences, Medicine
topic_facet Medizin, Gesundheit
contents Recent hardware development increase the computing power, in consequence many biological and chemical processes can now be successfully modelled in a way which was not to imagine 20 years ago. Examples of such processes are molecular dynamics studies of large biomolecules, the prediction of free energy of binding for protein-ligand complexes, investigations of reaction paths in enzymes, to mention only a few. One issue which is still unresolved concerns the accurate estimation of protonation states in protein-ligand complexes. In this thesis, we present the development of a novel charge assignment procedure named PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimized for Poisson-Boltzmann calculations), which represents a method for the assignment of atomic partial charges. It works reliably with both proteins and small organic molecules using a consistent approach. Such charges are a key parameter in Poisson-Boltzmann (PB) calculations, which are a well-established method for pKa calculations of proteins. The development of the PEOE PB charges is necessary, because no generic procedure exists to perform PB-based pKa calculations of protein-ligand complexes. The development of the PEOE PB charges is described in section 2. We adapted the PEOE formalism to optimally predict solvation free energies of small organic molecules. Modifications were performed in a heuristic manner, i.e. purely result-oriented. The changes considered exclusively parameter a of the PEOE polynomial (see section 2.2.1). In our optimization protocol, we first attempted to reproduce best solvation free energies of the polar amino acids (r2 is 0.94, RMSD is 0.84) and continued with a dataset of 80 small organic molecules (r2 is 0.78, RMSD is 1.57). The latter step underlines the generic character of our PEOE PB charges. Subsequently, we performed calculations on a dataset of nine (apo) proteins with 132 experimentally determined pKa values and obtained an overall RMSD of 0.88. The dielectric constant of the protein is set to 20. Active site residues with highly shifted pKa values are given for two enzymes of the dataset. For these, the following issues were indicated: * The value of the dielectric constant has to be lowered from 20 to 4, which can be partially explained by the degree of burial of the binding pocket. * The orientation of the tyrosine OH group was observed to have a remarkable influence on the pKa value of an active site residue (a glutamate with a highly increased pKa value). This fact emphasizes that the position of polar hydrogens can be crucial. In the final step of our PEOE PB validation study, we performed pKa calculations for three protein-ligand complexes, where experiment revealed a proton transfer. All our calculations agree with the experimental findings. In section 3, we describe pKa calculations for a series of ligands binding to the serine proteases trypsin and thrombin. For the studied complexes, we previously performed an extensive ITC and crystallographic study and were able to identify protonation changes for four complexes [22]. However, since ITC measures only the overall proton exchange, it does not provide structural insights into the functional groups involved in the proton transfer. By using Poisson-Boltzmann calculations based on our PEOE PB charges, we compute pKa values for all complexes from our previous work in order to reveal the residues with altered protonation states. The results indicate that His57, a member of the catalytic triad, is responsible for the most relevant pKa shifts resulting in the experimentally detected protonation changes. This ®nding is in contrast to our previous assumption that the observed protonation changes occur at the carboxylic group of the ligands. The newly detected proton acceptor is used for a revised factorization of the ITC data, which is necessary in cases where the protonation inventory changes upon complexation. pKa values of complexes showing no change of protonation in the ITC experiment are reliably predicted in most cases, whereas predictions of strongly coupled systems remain problematic. Such coupled systems appear if two (or more) strongly interacting titratable groups are close to each other. The HIV protease (HIVP) is a prominent example of successful structure-based drug design, and it is a well-studied system for which, as experimental evidence shows, protonation changes in the active site occur upon ligand binding (section 4). In the apo enzyme, the catalytic dyad consisting of two aspartates is in the mono-protonated state. This protonation state can be altered by ligands bearing a cyclic urea moiety. Our PEOE PB charge model reliably suggests the experimentally determined protonation states in the active site of HIVP. Furthermore, we perform pKa calculations for two HIVP complexes with novel types of inhibitors developed and synthesized in our group [115, 114]. For these complexes, no experimental knowledge on the protonation states is given. For one of the compounds, containing a central pyrrolidine ring, the calculations predict that both catalytic aspartates should be deprotonated upon ligand binding (Table 4.12 and 4.13). Such a protonation pattern has yet not been observed in any HIVP complex. Similarly to the experimental trypsin/thrombin study, a combined crystallographic and thermodynamic investigation of the ligand complexation process of human aldose reductase (hAR) was performed in our group [23]. The ITC measurements detected a proton transfer induced by the ligand binding process. Our calculations suggest an active site tyrosine residue (Tyr48) as proton acceptor, which is equivalent to a deprotonated tyrosine in the holo enzyme. This is in agreement with the ITC results for the Tyr48Phe mutant. Good quantitative agreement with the ITC experiment is obtained for the hAR complexes with inhibitors bearing a carboxylic head group. In contrast, the calculations cannot reliably predict the properties of inhibitors with a cyclic hydantoin moiety. A possible explanation for the de®ciency is the fact that the ligand shows a strong electrostatic interaction with the active site tyrosine and lysine residues. Furthermore, its pKa value in aqueous solutions falls next tothe physiological pH range which makes the system very sensitive to the actual pKa shifts. One limiting factor for the large-scale application of the pKa calculation methodology presented here concerns the ligand processing. For this purpose, we included the PEOE_PB algorithm in the PDB2PQR program. This tool serves as the input file generator for the Poisson-Boltzmann solver APBS. Besides the fully flexible ligand consideration within the PDB2PQR framework, substructure matching has been enabled for the ligand. With this technique, it is possible to automatically detect titratable groups of the ligand and assign pKa values. These pKa values originate from a database which has designed built and currently contains 348 molecules with experimentally determined pKa values.
author Czodrowski, Paul
building Fachbereich Pharmazie
description Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser Biomoleküle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die Abschätzung von Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert für Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl für Proteine als auch für kleine organische Moleküle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufÃ�hren. Der PEOE-Ansatz wurde gewählt, um zunächst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer Moleküle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Änderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunächst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosÃ�uren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekÃ�ulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend führten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die Dielektrizitätskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. Aminosäurereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FÃ�llen wurden folgende Beobachtungen gemacht: * Die Dielektrizitätskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklärt werden kann. * Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines Aminosäurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome. Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung führten wir pKa-Berechnungen für drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen Fällen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment überein. In einer folgenden reinen Anwendungstudie führten wir pKa-Berechnungen für eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausführliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und für vier dieser Komplexe konnten Ã�nderungen in den ProtonierungszustÃ�nden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ã�nderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darüber geben, welche funktionellen Gruppen tatsächlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, führten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) für die wichtigsten pKa-Änderungen, die sich im Experiment als Ã�nderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frÃ�heren Annahme, dass die Ã�nderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde für die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig für Fälle, in denen sich die Protonierung während der Komplexbildung ändert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Änderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten Fällen verlässlich vorhergesagt, während dies in Fällen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche Fälle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen räumlich nahe beiander liegen. Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel für erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Änderungen des Protonierungszustandes während der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt für eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich ändern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner führten wir pKa-Berechnungen für zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen Fällen gibt es keinerlei experimentelle Daten für die Protonierungszustände. Einer der Inhibitoren enthält ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode. Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. Während bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wässriger LÃ�sung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfälig für kleine Ã�nderungen des pKa-Wertes macht. Ein limitierender Faktor für die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien für das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur für gemeinsame Substrukturen eingeführt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 Moleküle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthält.
first_indexed 2006-12-21T00:00:00Z
institution Pharmazeutische Chemie
format Dissertation
publishDate 2006
era_facet 2006
publisher Philipps-Universität Marburg
last_indexed 2011-08-10T23:59:59Z
language German
title_alt Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
thumbnail http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0801/cover.png
spelling diss/z2006/0801 Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding Recent hardware development increase the computing power, in consequence many biological and chemical processes can now be successfully modelled in a way which was not to imagine 20 years ago. Examples of such processes are molecular dynamics studies of large biomolecules, the prediction of free energy of binding for protein-ligand complexes, investigations of reaction paths in enzymes, to mention only a few. One issue which is still unresolved concerns the accurate estimation of protonation states in protein-ligand complexes. In this thesis, we present the development of a novel charge assignment procedure named PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimized for Poisson-Boltzmann calculations), which represents a method for the assignment of atomic partial charges. It works reliably with both proteins and small organic molecules using a consistent approach. Such charges are a key parameter in Poisson-Boltzmann (PB) calculations, which are a well-established method for pKa calculations of proteins. The development of the PEOE PB charges is necessary, because no generic procedure exists to perform PB-based pKa calculations of protein-ligand complexes. The development of the PEOE PB charges is described in section 2. We adapted the PEOE formalism to optimally predict solvation free energies of small organic molecules. Modifications were performed in a heuristic manner, i.e. purely result-oriented. The changes considered exclusively parameter a of the PEOE polynomial (see section 2.2.1). In our optimization protocol, we first attempted to reproduce best solvation free energies of the polar amino acids (r2 is 0.94, RMSD is 0.84) and continued with a dataset of 80 small organic molecules (r2 is 0.78, RMSD is 1.57). The latter step underlines the generic character of our PEOE PB charges. Subsequently, we performed calculations on a dataset of nine (apo) proteins with 132 experimentally determined pKa values and obtained an overall RMSD of 0.88. The dielectric constant of the protein is set to 20. Active site residues with highly shifted pKa values are given for two enzymes of the dataset. For these, the following issues were indicated: * The value of the dielectric constant has to be lowered from 20 to 4, which can be partially explained by the degree of burial of the binding pocket. * The orientation of the tyrosine OH group was observed to have a remarkable influence on the pKa value of an active site residue (a glutamate with a highly increased pKa value). This fact emphasizes that the position of polar hydrogens can be crucial. In the final step of our PEOE PB validation study, we performed pKa calculations for three protein-ligand complexes, where experiment revealed a proton transfer. All our calculations agree with the experimental findings. In section 3, we describe pKa calculations for a series of ligands binding to the serine proteases trypsin and thrombin. For the studied complexes, we previously performed an extensive ITC and crystallographic study and were able to identify protonation changes for four complexes [22]. However, since ITC measures only the overall proton exchange, it does not provide structural insights into the functional groups involved in the proton transfer. By using Poisson-Boltzmann calculations based on our PEOE PB charges, we compute pKa values for all complexes from our previous work in order to reveal the residues with altered protonation states. The results indicate that His57, a member of the catalytic triad, is responsible for the most relevant pKa shifts resulting in the experimentally detected protonation changes. This ®nding is in contrast to our previous assumption that the observed protonation changes occur at the carboxylic group of the ligands. The newly detected proton acceptor is used for a revised factorization of the ITC data, which is necessary in cases where the protonation inventory changes upon complexation. pKa values of complexes showing no change of protonation in the ITC experiment are reliably predicted in most cases, whereas predictions of strongly coupled systems remain problematic. Such coupled systems appear if two (or more) strongly interacting titratable groups are close to each other. The HIV protease (HIVP) is a prominent example of successful structure-based drug design, and it is a well-studied system for which, as experimental evidence shows, protonation changes in the active site occur upon ligand binding (section 4). In the apo enzyme, the catalytic dyad consisting of two aspartates is in the mono-protonated state. This protonation state can be altered by ligands bearing a cyclic urea moiety. Our PEOE PB charge model reliably suggests the experimentally determined protonation states in the active site of HIVP. Furthermore, we perform pKa calculations for two HIVP complexes with novel types of inhibitors developed and synthesized in our group [115, 114]. For these complexes, no experimental knowledge on the protonation states is given. For one of the compounds, containing a central pyrrolidine ring, the calculations predict that both catalytic aspartates should be deprotonated upon ligand binding (Table 4.12 and 4.13). Such a protonation pattern has yet not been observed in any HIVP complex. Similarly to the experimental trypsin/thrombin study, a combined crystallographic and thermodynamic investigation of the ligand complexation process of human aldose reductase (hAR) was performed in our group [23]. The ITC measurements detected a proton transfer induced by the ligand binding process. Our calculations suggest an active site tyrosine residue (Tyr48) as proton acceptor, which is equivalent to a deprotonated tyrosine in the holo enzyme. This is in agreement with the ITC results for the Tyr48Phe mutant. Good quantitative agreement with the ITC experiment is obtained for the hAR complexes with inhibitors bearing a carboxylic head group. In contrast, the calculations cannot reliably predict the properties of inhibitors with a cyclic hydantoin moiety. A possible explanation for the de®ciency is the fact that the ligand shows a strong electrostatic interaction with the active site tyrosine and lysine residues. Furthermore, its pKa value in aqueous solutions falls next tothe physiological pH range which makes the system very sensitive to the actual pKa shifts. One limiting factor for the large-scale application of the pKa calculation methodology presented here concerns the ligand processing. For this purpose, we included the PEOE_PB algorithm in the PDB2PQR program. This tool serves as the input file generator for the Poisson-Boltzmann solver APBS. Besides the fully flexible ligand consideration within the PDB2PQR framework, substructure matching has been enabled for the ligand. With this technique, it is possible to automatically detect titratable groups of the ligand and assign pKa values. These pKa values originate from a database which has designed built and currently contains 348 molecules with experimentally determined pKa values. Vorhersage von Protonierungszuständen in Ligand-Protein Komplexen bei Ligandenbindung Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser Biomoleküle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die Abschätzung von Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert für Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl für Proteine als auch für kleine organische Moleküle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufÃ�hren. Der PEOE-Ansatz wurde gewählt, um zunächst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer Moleküle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Änderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunächst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosÃ�uren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekÃ�ulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend führten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die Dielektrizitätskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. Aminosäurereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FÃ�llen wurden folgende Beobachtungen gemacht: * Die Dielektrizitätskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklärt werden kann. * Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines Aminosäurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome. Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung führten wir pKa-Berechnungen für drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen Fällen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment überein. In einer folgenden reinen Anwendungstudie führten wir pKa-Berechnungen für eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausführliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und für vier dieser Komplexe konnten Ã�nderungen in den ProtonierungszustÃ�nden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ã�nderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darüber geben, welche funktionellen Gruppen tatsächlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, führten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) für die wichtigsten pKa-Änderungen, die sich im Experiment als Ã�nderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frÃ�heren Annahme, dass die Ã�nderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde für die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig für Fälle, in denen sich die Protonierung während der Komplexbildung ändert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Änderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten Fällen verlässlich vorhergesagt, während dies in Fällen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche Fälle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen räumlich nahe beiander liegen. Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel für erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Änderungen des Protonierungszustandes während der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt für eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich ändern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner führten wir pKa-Berechnungen für zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen Fällen gibt es keinerlei experimentelle Daten für die Protonierungszustände. Einer der Inhibitoren enthält ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode. Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. Während bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wässriger LÃ�sung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfälig für kleine Ã�nderungen des pKa-Wertes macht. Ein limitierender Faktor für die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien für das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur für gemeinsame Substrukturen eingeführt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 Moleküle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthält. 2006-12-21 opus:1508 2006-11-24 urn:nbn:de:hebis:04-z2006-08011 2006 2011-08-10 Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding ths Prof. Dr. Klebe Gerhard Klebe, Gerhard (Prof. Dr.) Czodrowski, Paul Czodrowski Paul Philipps-Universität Marburg
recordtype opus
id urn:nbn:de:hebis:04-z2006-0801
urn_str urn:nbn:de:hebis:04-z2006-08011
collection Monograph
uri_str http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0801
callnumber-raw diss/z2006/0801
callnumber-search diss/z2006/0801
callnumber-sort diss/z2006/0801
callnumber-label diss z2006 0801
callnumber-first diss
callnumber-subject diss z2006
_version_ 1563293731030827008
score 9,613937