Chemoenzymatische Synthese von Bacitracin-Derivaten und Untersuchungen zur Optimierung der in vitro Zyklisierung des Surfactins

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind modular aufgebaute Multienzymkomplexe, die in der Natur für die Synthese einer Vielzahl strukturell diverser Peptide mit bedeutenden pharmakologischen Wirkungsprofilen verantwortlich sind. Ein wichtiges Merkmal vieler dieser Peptide stellen zyklische Str...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Wagner, Björn
Beteiligte: Marahiel, A. Mohamed (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2006
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind modular aufgebaute Multienzymkomplexe, die in der Natur für die Synthese einer Vielzahl strukturell diverser Peptide mit bedeutenden pharmakologischen Wirkungsprofilen verantwortlich sind. Ein wichtiges Merkmal vieler dieser Peptide stellen zyklische Strukturen dar, die für die Bioaktivität und Stabilität dieser Naturstoffe essentiell sind. Man unterscheidet bei diesen zyklischen Strukturen zwischen heterozyklischen Ringsystemen, die durch die Kondensation einer Aminosäuren-Seitenkettenfunktion mit dem peptidischen Rückgrat entstehen, und der Erzeugung von Makrozyklen, die im letzten Schritt der Peptidsynthese durch sogenannte Zyklasen (TE-Domänen) gebildet werden. Diese Arbeit beschreibt die Charakterisierung der Bacitracin-Zyklase, welches als PCP-TE-Konstrukt rekombinant produziert werden kann und in der Lage ist, synthetisch hergestellte lineare Bacitracin-Thiophenol-Substrate zu verzweigtkettigen Makrolaktamen umzusetzen. Durch diesen chemoenzymatischen Ansatz ist es möglich, nicht nur authentisches Bacitracin A herzustellen, sondern die Zyklase auch als molekulares Werkzeug für die Produktion zyklischer Bacitracin A-Derivate zu nutzen. In einem organisch-präparativen Ansatz wurden lineare Bacitracin-Substrate hergestellt, die anstelle des authentischen Thiazolin-Ringes einen Thiazol-, Oxazol-, oder Methyloxazolring enthalten und zu zyklischen Bacitracin-Derivaten umgesetzt werden konnten. Diese synthetisch hergestellten Bacitracin-Derivate wurden auf ihre Bioaktivtät getestet und zeigten alle eine antibiotische Aktivität gegen einen repräsentativen Gram-positiven Indikatorstamm. Weiterer Gegenstand dieser Arbeit ist die Etablierung organischer Lösungsmittel oder ionischer Flüssigkeiten als Ersatz für das wässrige Puffer-Milieu der Zyklisierungsreaktion der Surfactin-Zyklase (Srf-TE). Tatsächlich ist diese Zyklase in DMF in der Lage, eine Substrat-Zyklisierung zu katalysieren. Durch diese Aktivität war es zum ersten Mal möglich, eine quantitative Zyklisierung des authentischen Surfactin-Substrates, das N-terminal eine C14-Fettsäure enthält, zu erzielen. Auch die Rekonstitution der Zyklisierungseigenschaften einer Srf-TE(P26G)-Mutante konnte in DMF erreicht werden, wodurch die Position des Pro26 einem spezifischen Oxyanion-Motiv (P-x) zugeordnet werden kann, das in NPRS-Zyklasen konserviert vorliegt. Mutationsstudien im Konsensus-Motiv des nukleophilen Ellenbogens (G-x-S80-x-G) ergaben, dass durch Substitution der Oxyanion-Aminosäure Ala81 mit dem zusätzlichen Wasserstoffbrücken-Donor Serin, die Zyklisierung einer b-Aminofunktion für die Ausbildung eines zyklischen Surfactin-Laktams (Surfactam) genutzt werden kann.
Umfang:146 Seiten
DOI:10.17192/z2006.0688