FRET basierte Analyse der Oligomerisierung von NMDA Rezeptoruntereinheiten
Schüler, Thomas
Der N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR), ein Mitglied der Familie ionotroper Glutamatrezeptoren, ist maßgeblich an synaptischer Plastizität und neurodegenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt. Der NMDAR ist ein differenziell regulierter heterooligomerer Proteinkomplex aus 7 möglichen homologen Untereinheiten (NR1, NR2A-D, NR3A-B), die wahrscheinlich in unterschiedlichen stöchiometrischen Kombinationen oligomerisieren können.
Mit Hilfe der biophysikalischen Methode FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) wurden die verschiedenen NMDA Rezeptoruntereinheiten auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Assemblierungsintermediate zu bilden. Die Analyse erfolgte anhand CFP (cyan fluorescent protein) - und YFP (yellow fluorescent protein) -markierter Untereinheiten nach heterologer Expression in HEK Zellen.
Die Untersuchung der Homooligomerisierung der Untereinheiten führte zu dem Ergebnis, dass lediglich NR1 Untereinheiten mit sich selbst assemblieren konnten. NR2 und NR3 Untereinheiten waren hingegen nicht in der Lage, homooligomere Komplexe zu bilden. Während eine Interaktion zwischen NR2 Untereinheiten nur in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen war, wurde die starke Wechselwirkung zwischen NR1 Untereinheiten durch die zusätzliche Anwesenheit der NR2 Untereinheit nicht signifikant beeinträchtigt. Die Untersuchung der Heterooligomerisierung zeigte Interaktionen zwischen NR1 und NR2 sowie zwischen NR1 und NR3 Untereinheiten. Beide Kombinationen führten jeweils zu funktionellen Kanälen, die im Fall von NR1/NR2 Rezeptoren durch Glutamat und Glycin, im Fall von NR1/NR3 Rezeptoren ausschließlich durch Glycin aktiviert wurden. Eine Wechselwirkung zwischen NR2 und NR3 Untereinheiten konnte nicht detektiert werden. Die Assemblierung dieser Untereinheiten war jedoch in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen.
Die Daten zeigen hinsichtlich des homo- und heterooligomeren Assemblierungsverhaltens einen deutlichen Unterschied zwischen NR1 Untereinheiten einerseits und NR2 bzw. NR3 Untereinheiten andererseits. Daraus lässt sich eine besondere Bedeutung der NR1 bei der Generierung von NMDA Rezeptoren ableiten. Die Ergebnisse deuten zudem darauf hin, dass der Oligomerisierungsprozess der NR1 das initiale Ereignis der Rezeptorassemblierung sein könnte. Dabei bildet der homooligomere NR1 Komplex vermutlich die strukturelle Voraussetzung für die weitere Anlagerung von NR2 und/oder NR3 Untereinheiten an diesen Komplex und beeinflusst somit entscheidend die Stöchiometrie des Rezeptors und die Anordnung der Untereinheiten.
Die erzielten Ergebnisse sind zudem ein indirekter Beweis für einen tetrameren NMDA Rezeptor mit einer Stöchiometrie von 2:2 für NR1/ NR2 und NR1/NR3 Rezeptoren als auch die Stöchiometrie von 2:1:1 für NR1/NR2/NR3 Rezeptoren. Ergänzt durch bisherige Untersuchungen zur Stöchiometrie von ionotropen Glutamatrezeptoren führten die Ergebnisse dieser Arbeit zum Postulat eines NMDA Rezeptors mit einer alternierenden Anordnung der enthaltenen Untereinheiten.
Die dargestellten Resultate vertiefen das Verständnis der Biogenese der Untereinheiten zum reifen Rezeptor und ermöglichen durch ein Modell der Rezeptorstöchiometrie weitere Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehungen des NMDA Rezeptors.
Philipps-Universität Marburg
Medical sciences Medicine
https://doi.org/10.17192/z2006.0275
opus:1335
urn:nbn:de:hebis:04-z2006-02756
Philipps-Universität Marburg
FRET
https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0275/cover.png
2011-08-10
Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg
Universitätsbibliothek Marburg
2006-04-11
FRET based analysis of NMDA receptor subunit oligomerization
doctoralThesis
2006-03-30
Der N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR), ein Mitglied der Familie ionotroper Glutamatrezeptoren, ist maßgeblich an synaptischer Plastizität und neurodegenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt. Der NMDAR ist ein differenziell regulierter heterooligomerer Proteinkomplex aus 7 möglichen homologen Untereinheiten (NR1, NR2A-D, NR3A-B), die wahrscheinlich in unterschiedlichen stöchiometrischen Kombinationen oligomerisieren können.
Mit Hilfe der biophysikalischen Methode FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) wurden die verschiedenen NMDA Rezeptoruntereinheiten auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Assemblierungsintermediate zu bilden. Die Analyse erfolgte anhand CFP (cyan fluorescent protein) - und YFP (yellow fluorescent protein) -markierter Untereinheiten nach heterologer Expression in HEK Zellen.
Die Untersuchung der Homooligomerisierung der Untereinheiten führte zu dem Ergebnis, dass lediglich NR1 Untereinheiten mit sich selbst assemblieren konnten. NR2 und NR3 Untereinheiten waren hingegen nicht in der Lage, homooligomere Komplexe zu bilden. Während eine Interaktion zwischen NR2 Untereinheiten nur in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen war, wurde die starke Wechselwirkung zwischen NR1 Untereinheiten durch die zusätzliche Anwesenheit der NR2 Untereinheit nicht signifikant beeinträchtigt. Die Untersuchung der Heterooligomerisierung zeigte Interaktionen zwischen NR1 und NR2 sowie zwischen NR1 und NR3 Untereinheiten. Beide Kombinationen führten jeweils zu funktionellen Kanälen, die im Fall von NR1/NR2 Rezeptoren durch Glutamat und Glycin, im Fall von NR1/NR3 Rezeptoren ausschließlich durch Glycin aktiviert wurden. Eine Wechselwirkung zwischen NR2 und NR3 Untereinheiten konnte nicht detektiert werden. Die Assemblierung dieser Untereinheiten war jedoch in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen.
Die Daten zeigen hinsichtlich des homo- und heterooligomeren Assemblierungsverhaltens einen deutlichen Unterschied zwischen NR1 Untereinheiten einerseits und NR2 bzw. NR3 Untereinheiten andererseits. Daraus lässt sich eine besondere Bedeutung der NR1 bei der Generierung von NMDA Rezeptoren ableiten. Die Ergebnisse deuten zudem darauf hin, dass der Oligomerisierungsprozess der NR1 das initiale Ereignis der Rezeptorassemblierung sein könnte. Dabei bildet der homooligomere NR1 Komplex vermutlich die strukturelle Voraussetzung für die weitere Anlagerung von NR2 und/oder NR3 Untereinheiten an diesen Komplex und beeinflusst somit entscheidend die Stöchiometrie des Rezeptors und die Anordnung der Untereinheiten.
Die erzielten Ergebnisse sind zudem ein indirekter Beweis für einen tetrameren NMDA Rezeptor mit einer Stöchiometrie von 2:2 für NR1/ NR2 und NR1/NR3 Rezeptoren als auch die Stöchiometrie von 2:1:1 für NR1/NR2/NR3 Rezeptoren. Ergänzt durch bisherige Untersuchungen zur Stöchiometrie von ionotropen Glutamatrezeptoren führten die Ergebnisse dieser Arbeit zum Postulat eines NMDA Rezeptors mit einer alternierenden Anordnung der enthaltenen Untereinheiten.
Die dargestellten Resultate vertiefen das Verständnis der Biogenese der Untereinheiten zum reifen Rezeptor und ermöglichen durch ein Modell der Rezeptorstöchiometrie weitere Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehungen des NMDA Rezeptors.
https://doi.org/10.17192/z2006.0275
FRET
2005
Medizin
ths
Prof. Dr.
McGregor
Gerald P.
McGregor, Gerald P. (Prof. Dr.)
monograph
The N-methyl-D-aspartate (NMDA) subtype of ionotropic glutamate receptors (iGluR) is a ligand-gated cation channel, which mediates excitatory neurotransmission in the central nervous system and plays a key role in brain development, synaptic plasticity and memory formation. NMDA receptors are obligatory heteromeric membrane proteins composed of the homologous NR1, NR2 and/or NR3 subunits. The combination of eight splice variants of the essential NR1 subunit with the differentially expressed NR2 isoforms (A, B, C, or D) and/or NR3 (A, B) isoforms gives rise to a multiplicity of temporarily and spatially regulated subtypes of NMDA receptors with distinct pharmacological properties and channel characteristics.
Using fluorescently tagged NR1, NR2A, NR2B and NR3A subunits and the biophysical approach fluorescence resonance energy transfer (FRET) putative protein-protein interactions of different subunit combinations were analyzed after heterologous expression in HEK cells.
When expressed alone, only the NR1 subunits do self-aggregate. Neither NR2 nor NR3 subunits could form homo-oligomeric complexes. Whereas the presence of NR1 resulted in an interaction between NR2 subunits, the additional presence of NR2 did not affect the strong interaction between NR1 subunits significantly. The combination of NR1 and NR2 as well as the combination of NR1 and NR3 resulted in the expression of functional channels and the detection of strong interactions between the different subunits. The NR1/NR3 NMDA receptor was activated exclusively by glycine and was not affected by glutamate or glutamatergic antagonists. No indications for a hetero-oligomerization of NR2 and NR3 subunits were found. The presence of NR1 resulted in an interaction between NR2 and NR3 subunits.
The data show a differential homo-oligomerization behavior of the NR1 versus the NR2 and NR3 subunits. The results indicate that homo-oligomerization of the NR1 subunit might be an initial step in receptor assembly and mandatory for the stable aggregation of each of the other subunits in the NMDA complex. Thus the NR1 might control the stoichiometry and the subunit arrangement of the NMDA receptor. The data are indirect evidence for the presence of two NR1 and two NR2 subunits in a tetrameric NMDA receptor. Based on additional analyses of the assembly of ionotropic glutamate receptors the data suggest a tetrameric NMDA receptor with an alternating arrangement of the subunits.
The results give rise to a better understanding of the subunit assembly and the biogenesis of a mature of NMDA receptor complex. In addition, a model of the receptor stoichiometry provides insight into the structure-function relation of NMDA receptors.
NMDA-Rezeptor
Assembly
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
opus:1335
Normale und Pathologische Physiologie
96
application/pdf
urn:nbn:de:hebis:04-z2006-02756
Medical sciences Medicine
Medizin
NMDA receptor
Schüler, Thomas
Schüler
Thomas
Assembly
German
FRET basierte Analyse der Oligomerisierung von NMDA Rezeptoruntereinheiten
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