FRET basierte Analyse der Oligomerisierung von NMDA Rezeptoruntereinheiten

Der N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR), ein Mitglied der Familie ionotroper Glutamatrezeptoren, ist maßgeblich an synaptischer Plastizität und neurodegenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt. Der NMDAR ist ein differenziell regulierter heterooligomerer Proteinkomplex aus 7 möglich...

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Main Author: Schüler, Thomas
Contributors: McGregor, Gerald P. (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Normale und Pathologische Physiologie
Subjects:
Online Access:PDF Full Text
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Description
Summary:Der N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR), ein Mitglied der Familie ionotroper Glutamatrezeptoren, ist maßgeblich an synaptischer Plastizität und neurodegenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem beteiligt. Der NMDAR ist ein differenziell regulierter heterooligomerer Proteinkomplex aus 7 möglichen homologen Untereinheiten (NR1, NR2A-D, NR3A-B), die wahrscheinlich in unterschiedlichen stöchiometrischen Kombinationen oligomerisieren können. Mit Hilfe der biophysikalischen Methode FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer) wurden die verschiedenen NMDA Rezeptoruntereinheiten auf ihre Fähigkeit hin untersucht, Assemblierungsintermediate zu bilden. Die Analyse erfolgte anhand CFP (cyan fluorescent protein) - und YFP (yellow fluorescent protein) -markierter Untereinheiten nach heterologer Expression in HEK Zellen. Die Untersuchung der Homooligomerisierung der Untereinheiten führte zu dem Ergebnis, dass lediglich NR1 Untereinheiten mit sich selbst assemblieren konnten. NR2 und NR3 Untereinheiten waren hingegen nicht in der Lage, homooligomere Komplexe zu bilden. Während eine Interaktion zwischen NR2 Untereinheiten nur in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen war, wurde die starke Wechselwirkung zwischen NR1 Untereinheiten durch die zusätzliche Anwesenheit der NR2 Untereinheit nicht signifikant beeinträchtigt. Die Untersuchung der Heterooligomerisierung zeigte Interaktionen zwischen NR1 und NR2 sowie zwischen NR1 und NR3 Untereinheiten. Beide Kombinationen führten jeweils zu funktionellen Kanälen, die im Fall von NR1/NR2 Rezeptoren durch Glutamat und Glycin, im Fall von NR1/NR3 Rezeptoren ausschließlich durch Glycin aktiviert wurden. Eine Wechselwirkung zwischen NR2 und NR3 Untereinheiten konnte nicht detektiert werden. Die Assemblierung dieser Untereinheiten war jedoch in Anwesenheit der NR1 Untereinheit nachzuweisen. Die Daten zeigen hinsichtlich des homo- und heterooligomeren Assemblierungsverhaltens einen deutlichen Unterschied zwischen NR1 Untereinheiten einerseits und NR2 bzw. NR3 Untereinheiten andererseits. Daraus lässt sich eine besondere Bedeutung der NR1 bei der Generierung von NMDA Rezeptoren ableiten. Die Ergebnisse deuten zudem darauf hin, dass der Oligomerisierungsprozess der NR1 das initiale Ereignis der Rezeptorassemblierung sein könnte. Dabei bildet der homooligomere NR1 Komplex vermutlich die strukturelle Voraussetzung für die weitere Anlagerung von NR2 und/oder NR3 Untereinheiten an diesen Komplex und beeinflusst somit entscheidend die Stöchiometrie des Rezeptors und die Anordnung der Untereinheiten. Die erzielten Ergebnisse sind zudem ein indirekter Beweis für einen tetrameren NMDA Rezeptor mit einer Stöchiometrie von 2:2 für NR1/ NR2 und NR1/NR3 Rezeptoren als auch die Stöchiometrie von 2:1:1 für NR1/NR2/NR3 Rezeptoren. Ergänzt durch bisherige Untersuchungen zur Stöchiometrie von ionotropen Glutamatrezeptoren führten die Ergebnisse dieser Arbeit zum Postulat eines NMDA Rezeptors mit einer alternierenden Anordnung der enthaltenen Untereinheiten. Die dargestellten Resultate vertiefen das Verständnis der Biogenese der Untereinheiten zum reifen Rezeptor und ermöglichen durch ein Modell der Rezeptorstöchiometrie weitere Einblicke in die Struktur-Funktionsbeziehungen des NMDA Rezeptors.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2006.0275