The common rue, Ruta graveolens L., is an aromatic plant. It contains acridone alkaloids, furoquinolines, coumarins, and numerous volatile compounds with antimicrobial and allelopathic activity. The starting point of this work was the biosynthesis of acridone alkaloids in Ruta graveolens L., that are restricted to the family of Rutaceae. The N-methylation of anthranilate by the anthranilate N-methyltransferase represents the first step in acridone alkaloid biosynthesis by which the anthranilic acid is removed from the primary metabolism. The anthranilate N-methyltransferase coding cDNA had to be isolated from R. graveolens cell culture material and the recombinant enzyme expressed and characterized. An appropriated method to clone an unknown protein is to isolate it from native tissue followed by microsequencing of the resulted peptides. Specific primers designed from the determined peptides would then be used for the cDNA amplification. In this work, 500 g wet weight of Ruta graveolens R-20 cells grown in suspension culture, were employed for a six-step purification strategy leading to a 450 times purification fold. The gel electrophoresis showed a polypeptide band with an apparent molecular weight of 42-43 kDa. Radioactive mesurements with [Methyl-14C]-SAM showed a high specific activity. The microsequencing of the protein, performed by Dr. Peter Hunziker (Biochemistry Department, University of Zürich), resulted in only five short peptide fragments with no homology with other known methyltransferases. Degenerated oligonucleotide primers, designed based on the peptide fragments, produced a PCR amplicon with no homology to methyltransferases. As the purification did not bring the desired result, degenerated oligonucleotide primers were designed based on the conserved motives (SAM binding site) in O-methyltransferases (OMT). With this method, two full length cDNAs were isolated, R-23 and R-27. R-23 was coding for a 366 amino acid protein with a calculated molecular weight of 40 kDa. R-27 was coding for a 41.6 kDa protein of 374 amino acid residues. These genes were cloned in pQE-60 vector and expressed in E. coli M-15. The protein R-23 had 79% similarity with caffeic acid O-methyltransferases and preserved all the amino acids important for methylation. R-27 showed all the important methyltransferases conserved motifs and had 50% similarity with a putative methyltransferase from Prunus dulcis respectively orcinol and chavicol O-methyltrasnferases from Rosa hybrida. Both bacterial overexpressed proteins were tested for substrate specificity. R-23 coded enzyme did not methylate any of the tested substrates, including caffeic acid. R-27 did methylate 3,5-dimethoxyphenol and other methoxylated phenols. The protein R-27 was purified in four chromatographic steps and characterized. The enzyme showed narrow substrate specificity. The highest affinity was with 3,5-dimethoxyphenol (Km 20.1 µM) with an optimum pH of 7.5. Other accepted substrates were: 3-methoxyphenol, guaiacol, 3,4-dimethoxyphenol and 3,5-dihydroxyanisole. The reaction was independent on cations. The optimum temperature was around 36+#730;C. On Coomassie stained SDS gel, the purified protein showed a characteristic band of 42 kDa. The calculated molecular weight from a calibrated size exclusion chromatographie was 84 kDa, suggesting that the native enzyme is a homodimer. The reaction product of 3,5-dimethoxyphenol methylation, 1,3,5-trimethoxybenzene is an important component of the scent of roses. Therefore, is reasonable to postulate that the product of the methylation described in this work is a volatile component of the scent of R. graveolens. Based on its substrate specificity, the protein was designated as 3,5-dimethoxyphenol O-methyltransferase. It could be shown that in the presence of Zn2+ the protein efficiently methylate DTT. The product was identified by LC-MS as monomethylthioether. Therefore, 3,5-dimethoxyphenol O-methyltransferase, in addition to the OMT activity, had a thiolmethyltransferase (TMT) activity. Kinetic analysis of 3,5-dimethoxyphenol methylation in the presence of various Zn2+/DTT concentrations showed a competitive DTT binding with an affinity of Ki = 52.0 µM. These results indicate that the OMT and TMT take place in the same active site of the enzyme. Altogether, these results suggest that the substrate specificity of plant O-methyltransferases II and their function in vivo is probably much wider as assumed. Methyltransferasen aus Ruta graveolens L.: Molekularbiologie und Biochemie monograph https://doi.org/10.17192/z2006.0106 Methyltransferase Philipps-Universität Marburg Ruta graveolens opus:1340 ths Prof. Dr. Matern Ulrich Matern, Ulrich (Prof. Dr.) ABB, 2005, 440(1), 54-64 Burga, Laura Burga Laura urn:nbn:de:hebis:04-z2006-01061 Acridonalkaloide Die gemeine Weinraute, Ruta graveolens L., ist eine aromatische Heilpflanze. Sie enthält Acridonalkaloide, Furoquinoline, Cumarin und zahlreiche leicht flüchtige Öle mit antimikrobieller bzw. allelopathischer Wirkung. Zentrales Thema der vorliegenden Arbeit war die Acridonalkaloid-Biosynthese in Ruta graveolens L., die allgemein nur in der Familie der Rutaceae gefunden wird. Der erste Schritt der Acridonsynthese ist die Athranylatmethylierung, die durch das Enzym Athranylsäure-N-methyltransferase (AANMT) katalysiert wird. Athranylsäure wird durch diese Reaktion dem Primärmetabolismus entnommen und das daraus resultierende N-Methylathranylat wird dem Sekundärmetabolismus zugeführt. Ziel war es, AANMT aus R. graveolens zu klonieren, um es anschließend rekombinant zu exprimieren, anzureichern und aufzureinigen. Eine biochemische Charakterisierung des Proteins sollte Aufschluss über dessen Funktion als Schlüsselprotein in der Acridonsynthese geben. Eine oft verwendete Methode zur Klonierung von unbekannten eukaryotischen Proteinen ist die Isolierung des entsprechenden Proteins aus nativem Gewebe und die anschließende Mikrosequenzierung des Peptids. Basierend auf der Peptidsequenz werden dann Primer synthetisiert, die das Klonieren des Gens von der cDNA ermöglichen. In dieser Arbeit wurde AANMT ausgehend von 500 g Nassgewicht R. graveolens Suspensionszellen der Zelllinie R-20 aufgereinigt und ~450-fach angereichert. Die Aufreinigung des Proteins erfolgte in sechs Schritten mit Hilfe von Proteinpräzipitation und verschiedenen Chromatographiesäulen. Die gelelektrophoretische Analyse des Proteins belegte dessen Reinheit und zeigte eine charakteristische Bande, die ein apparentes Molekulargewicht von 42-43 kDa hatte. Aktivitätstests mit C14-SAM belegten eine hohe spezifische Athranylat-N-Methyltransferase-Aktivität. Die Mikrosequenzierung des Proteins, durchgeführt von Dr. Peter Hunziker (Abteilung Biochemie, Universität Zürich), erbrachte jedoch nur fünf kurze Peptidfragmente, die keine Homologie zu bekannten Methyltransferase-Aminosäure-Sequenzen zeigten. PCR-Reaktionen mit degenerierten Primern, die basierend auf der Peptidfragmentsequenz synthetisiert wurden, erzielten ebenfalls nur DNA-Produkte, deren Sequenzen keine Homologie zu Methyltransferasen zeigten. Da mit dieser Methode AANMT nicht kloniert werden konnte, wurde eine andere Methode gewählt. Dafür wurden degenerierte Primer für die PCR eingesetzt, die konservierte SAM-Bindungsstellen in Pflanzenmethyltransferasen II amplifizieren. Es wurden zwei DNA-Fragmente erhalten, die anschließend komplett vervollständigt wurden und als R-23 bzw. R-27 bezeichnet wurden. R-23 codiert für ein 366 Aminosäuren unfassendes Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 40 kDa. R-27 codiert für ein 41.6 kDa Protein mit 374 Resten. Beide Gene wurden jeweils in einen pQE-60-Vektor kloniert und in E. coli M-15 exprimiert. Beide Proteinsequenzen zeigten keine Homologie zu bekannten Athranylat-N-Methyltransferasen. Das R-23 Protein wies jedoch eine Ähnlichkeit von 79% mit Kaffeesäure-O-methyltransferasen auf und enthielt alle konservierten für die Methylierung wichtigen Aminosäuren. Das R-27 Protein wies ebenfalls alle wichtigen konservierten Methyltransferase-Sequenzen auf und war in seiner Sequenz zu etwa 50% identisch mit einer putativen nicht näher charakterisierten Methyltransferase aus Prunus dulcis bzw. mit Orcinol/Chavicol-O-methyltransferase aus Rosa hybrida. Beide Proteine wurden in krudem E. coli-Zellextrakt auf ihre Substratspezifität und ihre katalytische Methylierungfunktion hin getestet. R-23 Protein methylierte keine der untersuchten Substrate, auch nicht Kaffeesäure. R-27 hingegen methylierte 3,5-Dimethoxyphenol und andere methoxylierte Phenole. Das R-27 Protein wurde in vier Schritten über Chromatographiesäulen aufgereinigt und genauer charakterisiert. Das Enzym wies eine sehr enge Substratspezifität auf. Die höchste Affinität zeigte es gegenüber 3,5-Dimethoxyphenol (Km = 20,1 µM) bei einem pH-Wert von 7,5. Aber auch 3-Methoxyphenol, Guaiacol, 3,4-Dimethoxyphenol und 3,5-Dihydroxyanisol wurden methyliert. Die Reaktion war unabhängig von Kationen. Das Temperaturoptimum lag bei 36+#730;C. Das aufgereinigte Protein zeigte im Coomassie-gefärbten SDS-Gel eine charakteristische Bande bei 42 kDa. Das Molekulargewicht, das durch kalibrierte Größenausschlusschromatographie ermittelt wurde, war jedoch 84 kDa. Dies lässt auf einen homodimeren nativen Zustand des Enzyms schließen. Das Reaktionsprodukt der 3,5-Dimethoxyphenol-Methylierung 1,3,5-Trimethoxybenzol ist ein wichtiger Bestandteil des Rosenduftes. Es liegt deshalb nahe, zu postulieren, dass das Produkt der in dieser Arbeit isolierten Methyltransferase R-27 in vivo ein Bestandteil der flüchtigen Aromen in R. graveolens darstellt. Das Protein wurde aufgrund seiner Substratspezifität als 3,5-Dimethoxyphenol-O-methyltransferase benannt. Es konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit von Zn2+ das Protein jedoch auch effizient DTT methylieren konnte. Das Produkt wurde durch LC-MS als Monomethylthioether identifiziert. 3,5-Dimethoxyphenol-O-methyltransferase hat also neben der OMT-Aktivität eine zusätzliche Thiolmethyltransferase (TMT)-Aktivität. Kinetische Experimente zur 3,5-Dimethoxyphenol-Methylierung in Anwesenheit von variierenden Zn2+/DTT-Konzentrationen zeigten eine kompetitive DTT-Bindung mit einer Affinität von Ki = 52,0 µM. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die OMT –und TMT-Aktivität im gleichen katalytischen Zentrum des Enzyms stattfindet. Allgemein zeigen die Resultate, dass die Substratspezifität der pflanzlichen O-Methyltransferasen II und deren physiologische Funktion in vivo wahrscheinlich breiter ist als angenommen. Methyltransferases from Ruta graveolens L.: Molecular Biology and Biochemistry Acridone Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg Ruta graveolens English Pharmazeutische Biologie Fachbereich Pharmazie 2006-05-03 Methyltransferase 2011-08-10 https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0106/cover.png Medical sciences Medicine Medizin 2005 doctoralThesis 143 application/pdf 2005-07-12