Methyltransferases from Ruta graveolens L.: Molecular Biology and Biochemistry

Die gemeine Weinraute, Ruta graveolens L., ist eine aromatische Heilpflanze. Sie enthält Acridonalkaloide, Furoquinoline, Cumarin und zahlreiche leicht flüchtige Öle mit antimikrobieller bzw. allelopathischer Wirkung. Zentrales Thema der vorliegenden Arbeit war die Acridonalkaloid-Biosynthese in Ruta graveolens L., die allgemein nur in der Familie der Rutaceae gefunden wird. Der erste Schritt der Acridonsynthese ist die Athranylatmethylierung, die durch das Enzym Athranylsäure-N-methyltransferase (AANMT) katalysiert wird. Athranylsäure wird durch diese Reaktion dem Primärmetabolismus entnommen und das daraus resultierende N-Methylathranylat wird dem Sekundärmetabolismus zugeführt. Ziel war es, AANMT aus R. graveolens zu klonieren, um es anschließend rekombinant zu exprimieren, anzureichern und aufzureinigen. Eine biochemische Charakterisierung des Proteins sollte Aufschluss über dessen Funktion als Schlüsselprotein in der Acridonsynthese geben. Eine oft verwendete Methode zur Klonierung von unbekannten eukaryotischen Proteinen ist die Isolierung des entsprechenden Proteins aus nativem Gewebe und die anschließende Mikrosequenzierung des Peptids. Basierend auf der Peptidsequenz werden dann Primer synthetisiert, die das Klonieren des Gens von der cDNA ermöglichen. In dieser Arbeit wurde AANMT ausgehend von 500 g Nassgewicht R. graveolens Suspensionszellen der Zelllinie R-20 aufgereinigt und ~450-fach angereichert. Die Aufreinigung des Proteins erfolgte in sechs Schritten mit Hilfe von Proteinpräzipitation und verschiedenen Chromatographiesäulen. Die gelelektrophoretische Analyse des Proteins belegte dessen Reinheit und zeigte eine charakteristische Bande, die ein apparentes Molekulargewicht von 42-43 kDa hatte. Aktivitätstests mit C14-SAM belegten eine hohe spezifische Athranylat-N-Methyltransferase-Aktivität. Die Mikrosequenzierung des Proteins, durchgeführt von Dr. Peter Hunziker (Abteilung Biochemie, Universität Zürich), erbrachte jedoch nur fünf kurze Peptidfragmente, die keine Homologie zu bekannten Methyltransferase-Aminosäure-Sequenzen zeigten. PCR-Reaktionen mit degenerierten Primern, die basierend auf der Peptidfragmentsequenz synthetisiert wurden, erzielten ebenfalls nur DNA-Produkte, deren Sequenzen keine Homologie zu Methyltransferasen zeigten. Da mit dieser Methode AANMT nicht kloniert werden konnte, wurde eine andere Methode gewählt. Dafür wurden degenerierte Primer für die PCR eingesetzt, die konservierte SAM-Bindungsstellen in Pflanzenmethyltransferasen II amplifizieren. Es wurden zwei DNA-Fragmente erhalten, die anschließend komplett vervollständigt wurden und als R-23 bzw. R-27 bezeichnet wurden. R-23 codiert für ein 366 Aminosäuren unfassendes Protein mit einem berechneten Molekulargewicht von 40 kDa. R-27 codiert für ein 41.6 kDa Protein mit 374 Resten. Beide Gene wurden jeweils in einen pQE-60-Vektor kloniert und in E. coli M-15 exprimiert. Beide Proteinsequenzen zeigten keine Homologie zu bekannten Athranylat-N-Methyltransferasen. Das R-23 Protein wies jedoch eine Ähnlichkeit von 79% mit Kaffeesäure-O-methyltransferasen auf und enthielt alle konservierten für die Methylierung wichtigen Aminosäuren. Das R-27 Protein wies ebenfalls alle wichtigen konservierten Methyltransferase-Sequenzen auf und war in seiner Sequenz zu etwa 50% identisch mit einer putativen nicht näher charakterisierten Methyltransferase aus Prunus dulcis bzw. mit Orcinol/Chavicol-O-methyltransferase aus Rosa hybrida. Beide Proteine wurden in krudem E. coli-Zellextrakt auf ihre Substratspezifität und ihre katalytische Methylierungfunktion hin getestet. R-23 Protein methylierte keine der untersuchten Substrate, auch nicht Kaffeesäure. R-27 hingegen methylierte 3,5-Dimethoxyphenol und andere methoxylierte Phenole. Das R-27 Protein wurde in vier Schritten über Chromatographiesäulen aufgereinigt und genauer charakterisiert. Das Enzym wies eine sehr enge Substratspezifität auf. Die höchste Affinität zeigte es gegenüber 3,5-Dimethoxyphenol (Km = 20,1 µM) bei einem pH-Wert von 7,5. Aber auch 3-Methoxyphenol, Guaiacol, 3,4-Dimethoxyphenol und 3,5-Dihydroxyanisol wurden methyliert. Die Reaktion war unabhängig von Kationen. Das Temperaturoptimum lag bei 36˚C. Das aufgereinigte Protein zeigte im Coomassie-gefärbten SDS-Gel eine charakteristische Bande bei 42 kDa. Das Molekulargewicht, das durch kalibrierte Größenausschlusschromatographie ermittelt wurde, war jedoch 84 kDa. Dies lässt auf einen homodimeren nativen Zustand des Enzyms schließen. Das Reaktionsprodukt der 3,5-Dimethoxyphenol-Methylierung 1,3,5-Trimethoxybenzol ist ein wichtiger Bestandteil des Rosenduftes. Es liegt deshalb nahe, zu postulieren, dass das Produkt der in dieser Arbeit isolierten Methyltransferase R-27 in vivo ein Bestandteil der flüchtigen Aromen in R. graveolens darstellt. Das Protein wurde aufgrund seiner Substratspezifität als 3,5-Dimethoxyphenol-O-methyltransferase benannt. Es konnte gezeigt werden, dass in Anwesenheit von Zn2+ das Protein jedoch auch effizient DTT methylieren konnte. Das Produkt wurde durch LC-MS als Monomethylthioether identifiziert. 3,5-Dimethoxyphenol-O-methyltransferase hat also neben der OMT-Aktivität eine zusätzliche Thiolmethyltransferase (TMT)-Aktivität. Kinetische Experimente zur 3,5-Dimethoxyphenol-Methylierung in Anwesenheit von variierenden Zn2+/DTT-Konzentrationen zeigten eine kompetitive DTT-Bindung mit einer Affinität von Ki = 52,0 µM. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die OMT –und TMT-Aktivität im gleichen katalytischen Zentrum des Enzyms stattfindet. Allgemein zeigen die Resultate, dass die Substratspezifität der pflanzlichen O-Methyltransferasen II und deren physiologische Funktion in vivo wahrscheinlich breiter ist als angenommen.