Philipps-Universität Marburg 2006 2006-02-17 Die chemisch schwierige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Kresol wird durch das Enzym 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4-Hpd) katalysiert. Dieses Enzym wurde gereinigt und als Prototyp einer neuen Gruppe innerhalb der Glycylradikalfamilie (GREs) charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass dieses System in C. difficile Eigenschaften aufweist, die es von den gut untersuchten Systemen Pyruvat Format Lyase (Pfl) und anaerobe Ribonucleotid Reduktase (Nrd) unterscheiden. In dieser Arbeit wurden ähnliche Gene aus Clostridium scatologenes (Csd) und Tannerella forsythensis (Tfd) kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden gereinigt und vorläufig charakterisiert. Die rekombinanten Decarboxylasen konnten als Hetereokotamere (HpdBC und CsdBC) oder Heterotetramerer (TfdBC) gereinigt werden, waren aus großen (B) und kleinen (C) Untereinheiten in äquimolaren Mengen zusammen gesetzt, und enthielten im Gegensatz zu Pfl und Nrd vier Eisen- und vier Schwefel-Atome pro Heterodimer. Während das Csd System 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase Aktivität zeigte und sowohl von CsdA als auch von HpdA aktiviert wurde, war das Tfd System unter allen getesteten Versuchsbedingungen inaktiv, zeigte aber eine teilweise Aktivierung zur Glycyl-Radikal-Form. Wurden die große Untereinheiten der einzelnen Decarboxylasen genetisch mit den kleinen Untereinheiten kombiniert, konnten in einigen Fällen lösliche Proteine gereinigt werden. Auch hier betrug das molare Verhältnis der beiden Untereinheiten 1:1 und es konnten Eisen und Schwefel nachgewiesen werden. Allerdings waren die nativen Komplexe dieser Proteine deutlich kleiner und konnten nicht in die Glycyl-Radikal-Form überführt werden. Die rekombinanten Aktivatoren (CsdA bzw. TfdA) waren Monomere und enthielten 7-8 Eisen- und 6-7 Schwefel-Atome pro Monomer, das auf einen zweiten, zusätzlich zu dem aus Pfl und Nrd bekannten, [4Fe-4S]-Kluster schließen ließ. Der im EPR detektierte, katalytisch entscheidende [4Fe-4S]+ Kluster wurde in CsdA und HpdA nachgewiesen, unterschied sich aber von den Signalen des Pfl- Activator sowie des Nrd- Activator; im Gegensatz zu letzteren beeinflusste die Substratbindung das EPR-Signal nicht signifikant. Der Aktivierungsprozess von CsdBC sowie HpdBC mit den jeweiligen Aktivatoren war transient; einem steilen Anstieg an spezifischer Aktivität in etwa 10 Minuten folgte ein langsamerer Inaktivierungsprozess mit einer Halbwertszeit von etwa 30 Minuten. Das hierbei das Glycylradikal verschwindet, konnte durch sauerstoff-induzierte Spaltung den aktiven Decarboxylase mittels SDS-PAGE sowie in EPR Messungen gezeigt werden. Ob diese Inaktivierung durch ein Elektron aus dem zusätzlichen [4Fe-4S]-Kluster des Aktivators verursacht wird oder durch den [4Fe4S]-Kluster der Decarboxylasen vermittelt wird, bleibt Gegenstand aktueller Untersuchungen monograph Publikationsserver der Universitätsbibliothek Marburg Universitätsbibliothek Marburg opus:1301 doctoralThesis 2011-08-10 Yu, Lihua Yu Lihua 2006-03-03 https://doi.org/10.17192/z2006.0083 The chemically difficult decarboxylation of 4-hydroxyphenylacetate to p-cresol is catalysed by the enzyme 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase (Hpd). The enzyme has been purified and characterised as the prototype of a novel class of glycyl radical enzymes (GREs). Previous studies have shown that the Hpd system from Clostridium difficile shows distinct properties, which distinguishes this novel GRE system from the well-characterised pyruvate formate lyase (Pfl) and anaerobic ribonucleotide reductase (Nrd) system. In this work, the similar genes from Clostridium scatologenes (Csd) and from Tannerella forsythensis (Tfd) were cloned and expressed in Escherichia coli. The individual recombinant proteins were produced in Escherichia coli, purified and initially characterized. The recombinant proteins of CsdBC (hetero-octamer) and TfdBC (hetero-tetramer) were composed of large and small subunits in a 1 to 1 molar ratio and contained 4 irons and 4 sulfurs per heterodimer as that of the HpdBC (hetero-octamer), which distinguishes these systems from Pfl and Nrd. While the Csd system exhibited 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase activity like Hpd and was activated by either HpdA or CsdA, the Tfd system was inactive under any conditions tested, but the glycyl radical formation was observed by EPR. When the glycyl radical subunits of the individual decarboxylases were genetically combined with the small subunits of the other systems, soluble recombinant proteins were formed and purified for some of these combinations. For all combinations yielding soluble enzymes, the molar ratio of the glycyl radical and small subunits was 1:1 and the presence of an iron-sulfur centre per hetero-dimer was evident, while the oligomeric state differed from the wild-type complexes, exhibiting a lower order of complexity. All the purified hybrid decarboxylases were inactive under current assay conditions. The recombinant activating enzymes (CsdA and TfdA) were monomers according to size exclusion chromatography and contained 7-8 mol iron and 6-7 mol acid labile sulfur per mol of enzyme, indicating at least one additional metal centre, as compared to the Pfl and Nrd activators. The catalytically essential [4Fe-4S]+ cluster in CsdA and HpdA was detected by EPR, which was different to that of Pfl-AE or Nrd-AE, there was no significant signal changes after addition of SAM. The activation of CsdBC or HpdBC by its cognate activating enzyme was transient, yielding maximum specific activities within 10 min followed by a slow inactivation with t1/2 ~ 30 min, which was accompanied by a quenching of the glycyl radical. This radical quenching process was monitored by using the oxygen-induced cleavage of decarboxylase on SDS-PAGE, and also by EPR. Combining these results, it was proposed that the second iron-sulfur centre (I-cluster, which located within a ~ 60 amino acids long insert between the SAM cluster and the first glycin-rich motif) could be responsible for the ‘inactivase’ activity of HpdA or CsdA. Alternatively, the unique metal centre in the GRE decarboxylase itself may provide the radical quenching properties of the systems. Biologie ths Dr. Selmer Thorsten Selmer, Thorsten (Dr.) Life sciences Biowissenschaften, Biologie Glycylradikal-Decarboxylase SAM-radikal Familie urn:nbn:de:hebis:04-z2006-00837 Zwei neue Glycylradikal-Decarboxylase-Systeme aus Clostridium scatologenes und Tannerella forsythensis https://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2006/0083/cover.png Glycyl radical enzyme Fachbereich Biologie English 122 application/pdf SAM-radical family Two novel glycyl radical decarboxylase systems from Clostridium scatologenes and Tannerella forsythensis