In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum

Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind,...

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Main Author: Freymark, Gerald
Contributors: Bölker, Michael (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2006.0064