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Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode
Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrun...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären.
In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat.
Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen.
Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden.
In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet.
In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat. |
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| Umfang: | 139 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2006.0061 |