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Nicotinatfermentation in Eubacterium barkeri
Aus EcoRI- und BamHI/BglII-Phagen-Genbänken von Eubacterium barkeri wurde mit Hilfe Digoxigenin-markierten homologen DNA-Sonden, direkter genomischer Sequenzierung und Seegene Speedwalking ein Gencluster von 23 kbp kloniert, das für die Enzyme der Nicotinatfermentation kodierte. Nach Sequenzierung u...
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| 1. Verfasser: | |
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| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Aus EcoRI- und BamHI/BglII-Phagen-Genbänken von Eubacterium barkeri wurde mit Hilfe Digoxigenin-markierten homologen DNA-Sonden, direkter genomischer Sequenzierung und Seegene Speedwalking ein Gencluster von 23 kbp kloniert, das für die Enzyme der Nicotinatfermentation kodierte. Nach Sequenzierung und Analyse wurden die folgenden 22 offenen Leserahmen identifiziert. Die ndhFSLM Gene kodieren für die Untereinheiten der Nicotinat-Dehydrogenase, deren Aminosäuresequenzen signifikante Identitäten zu Xanthin-Dehydrogenase aufweisen. hnr kodiert für die 6-Hydroxynicotinat-Reduktase, ein [2Fe-2S]+x 2 x [4Fe-4S] Enzym mit kovalent gebundenem Flavin. ena kodiert für die Enamidase, deren Aminosäuresequenz eine Zugehörigkeit zur Amidohydrolase Superfamilie aufweist, und hgd für die 2-(Hydroxymethyl)glutarat-Dehydrogenase. Die dmdAB Gene (60-73 % Aminosäuresequenz-Identität zu Isopropylmalat-Isomerase) kodieren für die beiden Untereinheiten der Dimethylmalat-Dehydratase. Über die Aminosäuresequenzenidentität zur α-Untereinheit der [4Fe-4S]-Serin-Dehydratase (23-26 %) wurde hmd als Gen potentiell identifiziert, das für die 2-(Hydroxymethyl)glutarat-Dehydratase kodiert. Mit den bereits vorher charakterisierten mgm (2-Methylglutarat-Mutase), mii (3-Methylitaconat-Isomerase), mgmL (2-Methylglutarat-Mutase Reaktivase/Stabilisierungsfaktor) und dml (Dimethylmalat-Lyase) Genen sind jetzt die Primärstrukturen aller Enzyme der Nicotinatfermentation identifiziert. Neben diesen Genen wurden zwischen den Nicotinat-Fermentationsgenen die orfC, orfD und orfE Gene, stromaufwärts von hnr die nicR, orfA und orfB Gene, und stromabwärts von dmdAB die orfF und orfG Gene angetroffen. Außer für nicR (potentieller Regulator) und orfC und orfE (grenzend an hnr-Homologen) konnte eine Beteiligung am Nicotinatabbau noch nicht aufgeklärt werden. Über die Sequenzen von Hnr und Ena wurden in 6 Proteobakterien Gencluster für den Abbau von Nicotinat zu 2-Formylglutarat gefunden.
Für biochemische Untersuchungen wurden ena und hgd heterolog in E. coli exprimiert. Die mit N-terminalen Streptags versetzte Enamidase und 2-(Hydroxymethyl)glutarat-Dehydrogenase wurden mit Streptactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Die kinetischen Parameter wurden bestimmt.
Die Kristallstruktur der Enamidase von E. barkeri wurde in Zusammenarbeit mit der AG Essen zu einer Auflösung von 1,89 Å bestimmt. Gemäss Metallanalyse wurden im Homotetramer vier binukleäre Eisen-Zink Zentren gefunden. Glutamat, Chlorid und ein Sauerstoff Atom verbrückten die Metallionen. |
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| Umfang: | 112 Seiten |
| DOI: | 10.17192/z2005.0501 |