The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer

Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorar...

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Abuharbeid Shaker
Beteiligte: Czubayko, Frank (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Englisch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Pharmakologie und Toxikologie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2). FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann. Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert. Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen. HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht. Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert. Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2. Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0497