Transcription factor Sp2: Molecular characterization and generation of Sp2 gene targeted mice

Zusammenfassung Die Familie der Sp-Transkriptionsfaktoren charakterisiert sich durch ihre DNA-Bindungsdomäne, bestehend aus drei C-terminalen Zinkfingern vom Typus C2H2. Als Folge dieses hochkonservierten DNA-Bindungsmotivs erkennen die einzelnen Mitglieder der Sp-Familie jeweils mit gleicher Spezifität und Affinität sogenannte GC- (GGGGCGGGG) und GT- (GGTGTGGGG) Boxen. GC- und GT-Boxen sind von großer Bedeutung für die Expressionsregulation verschiedenster ubiquitärer, ge-webespezifischer und viraler Gene. Bis jetzt wurden neun Mitglieder der Sp-Familie identifiziert (Sp1 bis Sp9). Zusätzlich zur charakteristischen DNA-Bindungsdomäne besitzen die Transkriptionsfaktoren Sp1 bis Sp4 weitere strukturelle Gemeinsam-keiten, wie z.B. zwei glutaminreiche Transaktivierungs-domänen oder zwei serin-/threoninreiche Regionen. Molekulare sowie funktionelle Eigenschaften sind für die Faktoren Sp1, Sp3 und Sp4 beschrieben. Entsprechende Maus-Knockouts bele-gen ihre vielfältige Funktion und essentielle Bedeutung bei der Säugerentwicklung. Seit der Klonierung von Sp2, dem am wenigsten konservierten Mitglied der aus Sp1-4 bestehenden glutaminreichen Unterfamilie, wurden keine weiteren Daten hinsichtlich seiner Funktion in vivo oder in vitro publiziert. Aus diesem Grunde war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Untersuchung der Sp2-Funktion mittels zwei verschiedener Ansätze: einer funktionellen molekularen Charakterisierung, welche unter anderem Expressions-, Transaktivierungs- und DNA-Bindungsstudien bein-haltete, sowie der Herstellung von Sp2-Knockout-Mäusen. Zur Untersuchung der Sp2-Funktion auf molekularer Ebene wurden polyklonale, Sp2-spezifische Antikörper hergestellt und für Expressionsstudien eingesetzt. Es zeigte sich, daß Sp2 ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist und in allen geteste-ten Zelllinien und Mausgeweben exprimiert wird, wenn auch in unterschiedlichen Mengen. Dies spricht für eine weitläufige bis ubiquitäre Expression in der Maus. In einem zweiten Schritt wurde die Fähigkeit von Sp2 analysiert, Promotoren zu akti-vieren, die GC- bzw. GT-Boxen als Regulationselemente beinhalten. Hierzu wurden Reporterassays mit Wildtyp-Sp2-Protein sowie verschiedenen Sp2-Deletionsmutanten durchgeführt. Im Gegensatz zum Transkriptionsfaktor Sp1, der einen starken Aktivator darstellt, aktivierte keines der untersuchten Sp2-Varianten die Expression der Reportergene. Auch wenn Sp2-Fragmente an eine heterologe DNA-Bindungsdomäne fusioniert waren, konnte keine Aktivierung festgestellt wer-den. Zusätzlich wurde mittels Gelretardationsexperimenten die Fähigkeit und Spe-zifität von Sp2, DNA zu binden, untersucht. Es zeigte sich, daß Wildtyp-Sp2-Protein nicht in der Lage war, an DNA zu binden, weder an GC-Boxen („klassische“ Sp1-Bindungsstelle) noch an GC-Box-Varianten oder andere DNA-Bindungssequenzen, wie GT- oder CT-Boxen. Wurden jedoch die N-terminalen Aminosäuren 1-179 deletiert, erfolgte die Bindung an die DNA. Diese Befunde sprechen dafür, daß der Prozeß der Sp2-DNA-Interaktion in vivo reguliert ist. Zur Ermittlung der physiologischen Funktion von Sp2, wurden Sp2-Knockout-Mäuse hergestellt. Diese Mäuse sind nicht lebensfähig; sie sterben kurz vor bzw. nach der Geburt. Während Sp2-mutierte Embryonen bis zum Tag E12,5 keine erkennbaren Abnormalitäten aufweisen, sind die Körpergröße und das -gewicht von Embryonen am Tag E18,5 im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduziert, wenn auch mit großer Varianz. Diese Ergebnisse verdeutlichen, daß der Transkriptionsfaktor Sp2 essentiell für eine normale Mausentwicklung ist. In welche Differenzierungsprozesse er im Detail involviert ist, müssen weitere Untersuchungen zeigen.