Regulationsmechanismen des Interferon regulatorischen Faktors IRF-4 in der chronisch myeloischen Leukämie

Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Gruppe der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF), darunter insbesondere ICSBP und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der chronischen Phase ist die IRF-4-Expression im Verg...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Ortmann, Christina
Beteiligte: Neubauer, Andreas (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Zahlreiche Untersuchungen weisen darauf hin, dass die Gruppe der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRF), darunter insbesondere ICSBP und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der chronischen Phase ist die IRF-4-Expression im Vergleich zu Normalblut signifikant herunterreguliert. Eine Therapie mit Interferon-α vermag das IRF-4-Level der Patienten wieder anzuheben und zwischen gutem Ansprechen und hohem IRF-4-Level besteht eine positive Korrelation. Diese Daten könnten auf eine mögliche antileukämische Wirkungsweise von IRF-4 bei Erkrankungen des myeloiden Systems hinweisen. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der deregulierten IRF-4-Expression in Leukämiezellen untersucht. Die IRF-4-Promotor-Region von hämatopoetischen Zellinien, CML-Patienten und normalen Spendern als Kontrolle wurde dabei auf genetische und epigenetische Veränderungen untersucht. Um genetische Aberrationen auszuschließen, wurde der IRF-4-Promotor sequenziert. Dabei wurden keine genetischen Läsionen gefunden, die für die inhibierte IRF-4-Transkription verantwortlich sein könnten. Die detektierten Variationen an Position -1081 (T→C-Substitution), an Position -1068 (A→C-Substitution) und Position -116 (T→C-Substitution) finden sich sowohl in IRF-4-positiven als auch in IRF-4-negativen Zelllinien; die letztgenannte Substitution taucht zudem auch bei CML-Patienten in chronischer Phase und in Normalblut von Kontrollpersonen auf. Diese Basenpaarvariationen sind folglich sehr wahrscheinlich nicht die Ursache für die Expressionsunterschiede und stellen eher Polymorphismen dar. Keine der beschriebenen Sequenzänderungen betrifft eine bekannte Transkriptionsfaktorbindungsstelle. Die bei CML-Patienten in vivo nachgewiesene Induzierbarkeit der IRF-4-Expression macht reversible Inhibitionsmechanismen ohnehin wahrscheinlicher. Deshalb wurde der IRF-4-Promotor auf aberrante Methylierung untersucht, welche bereits bei einem anderen IRF, IRF-7, nachgewiesen wurde. Um die Relevanz dieses epigenetischen Mechanismus für die IRF-4-Regulation zu untersuchen, wurden verschiedene Zellinien mit demethylierenden Substanzen behandelt. Die Inkubation mit 5-Aza-2-deoxycytidin zeigte eine konzentrations- und zeitabhängige Aktivierung der IRF-4-Expression, die auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen werden konnte. Um den Methylierungsstatus des IRF-4-Promotors zu bestimmen, wurden ein Restriktions-PCR-Assay sowie die Sequenzierung des Promotors nach Bisulfit-Behandlung durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die IRF-4-negativen Zellinien ein höheres Methylierungslevel aufwiesen als die IRF-4-positiven Zellen und dass die IRF-4-Expression zudem mit dem Methylierungsstatus spezifischer CpGs im Promotor korreliert. Von besonderem Interesse ist dabei die Hypermethylierung einer NFκB-Bindungsstelle in IRF-4-negativen Zellinien. Die Bindung von c-Rel an NFκB-Elemente des Promotors spielt eine wichtige Rolle in der Induktion von IRF-4 und die Methylierung dieses Elements blockiert die Bindung des Transkriptionsfaktors. Ein im Anschluss an diese Arbeit durchgeführter Reporter-Gen-Assay konnte schließlich den inhibierenden Effekt von Methylierung auf den IRF-4-Promotor bestätigen. Die Bisulfit-Sequenzierung von DNA aus peripherem Blut von drei Normalpersonen und drei CML-Patienten in chronischer Phase zeigte keine aberrante Methylierung. Möglicherweise wurden hier jedoch die malignen Zellen im Gesamtblut nicht ausreichend erfasst; hier muss sich die Sequenzierung von sortierten Zellen anschließen. Eine mögliche und bei verschiedenen malignen Erkrankungen nachgewiesene Ursache für aberrante Methylierung ist die Überexpression von DNA-Methyltransferasen (DNMT). Die Expressionsanalyse der DNMTs (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B) und Methyl-CpG-Bindungsproteine (MBP) (MBD1, MBD2, MBD4, MeCP) zeigte jedoch keine konsistenten Unterschiede zwischen IRF-4-positiven und –negativen Zellinien, so dass der Hypermethylierung wahrscheinlich andere Mechanismen zugrunde liegen. Zusammenfassend lassen die erhobenen Daten die Schlussfolgerung zu, dass IRF-4-Promotor-Methylierung die IRF-4-Expression reguliert und das die aberrante Expression von IRF-4 in verschiedenen Leukämietypen eine Konsequenz einer IRF-4-Promotor-Hypermethylierung sein könnte. Inwieweit dieser Mechanismus in vivo wirksam ist, muss, beispielsweise durch Analyse von Subpopulationen aus Patientenproben, noch bestimmt werden.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0418