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Polyethylenimine- and lipid- based nanoparticles as gene and drug delivery systems for aerosol therapy to the lung
Inhalt dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung verschiedener polymer- und lipid-basierter nanopartikulärer Formulierungen mit dem Ziel, diese bei der inhalativen Behandlung von Lungenerkrankungen einzusetzen zu können. Eine Reihe von Polyethyleniminen (PEI) wurde auf ihre Verwendbark...
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| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Beteiligte: | |
| Format: | Dissertation |
| Sprache: | Englisch |
| Veröffentlicht: |
Philipps-Universität Marburg
2005
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| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | PDF-Volltext |
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| Zusammenfassung: | Inhalt dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung verschiedener polymer- und lipid-basierter nanopartikulärer Formulierungen mit dem Ziel, diese bei der inhalativen Behandlung von Lungenerkrankungen einzusetzen zu können. Eine Reihe von Polyethyleniminen (PEI) wurde auf ihre Verwendbarkeit als nicht-virale biokompatible DNA- Transporter für eine Lungen-Gentherapie untersucht (Kapitel 2-5). Eine weitere Studie (Kapitel 6) verfolgte das Ziel Liposomen zu entwickeln, die für eine kontrollierte Wirkstofffreigabe nach Inhalation geeignet sind.
Die Untersuchungen des Kapitels 2 stellen in dieser Dissertation, die Grundlage der Evaluierung von PEI als inhalierbare DNA Transporter zu dienen, dar. Es wurden vier verschiedene PEI-Modifikationen (verzweigtes, lineares, bioabbaubares & Polyethylenglycol-modifiziertes PEI) ausgewählt, die mit plasmidischer DNA (pDNA) Partikel in der Größenordnung von ca. 100 nm formten. Diese so genannten Polyplexe wurden hinsichtlich ihrer strukturellen und physikochemischen Veränderung während der Vernebelung mit einem Düsen- bzw. einem Ultraschallvernebler charakterisiert. Für diese Untersuchungen fanden verschiedene Techniken Anwendung, wie die Rasterkraftmikroskopie, die dynamische Lichtstreuung und die Laser Doppler Anemometrie. Damit konnten die Parameter Polyplex-Morphologie, Größe bzw. Zeta-Potential vor und nach den Vernebelungen bestimmt werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die PEI Modifikationen, die am stärksten die pDNA komplexierten, die geringsten Veränderungen während der Vernebelung erfuhren. Dabei hatte das Polyethylenglycol-PEI (PEGPEI) die besten Eigenschaften hinsichtlich, DNA Komplexierung und Schutz bei der Vernebelung. Ein Vergleich der beiden Verneblersysteme ergab, dass alle Polyplexe am stabilsten während der Ultraschallverneblung waren. Als Schlussfolgerung dieser Studie, stellten wir die Ultraschall-Vernebelung als die geeignetere Methode für die Verabreichung von PEI-basierten Gentransfersystemen in die Lunge heraus. Des Weiteren sind die guten Stabilitätseigenschaften des PEGPEI hervorzuheben, auf Grund dessen wir in den darauf folgenden Studien PEGPEI als Vektor, neben dem Standartvektor verzweigtes 25 kDa PEI (BPEI), für die Pulmonale DNA Applikation verwendeten.
Das Ziel der zweiten Studie (Kapitel 3) war die Entwicklung eines biokompatiblen und effizienten Systems für den Gentransport in die Lungen Epithelzellen. Dafür wurden zwei PEI Modifikationen verwendet, ein niedermolekulares PEI (LMWPEI) und das schon beschriebene PEGPEI, die mit dem Standart-Vektor BPEI verglichen wurden. Die Untersuchungen der Polyplex Morphologie (Rasterkraftmikroskopie), Größe (Dynamischer Lichtstreuung) und Zeta-Potential (Laser Doppler Anemometrie) zeigten, dass alle drei Polymere die pDNA vollständig kondensierten und mit dieser kleine, positiv geladene Partikel von ca. 100 nm formten. Zur Untersuchung der Polymer-Toxizität in vitro wurden MTT- und LDH-Assays durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, dass das LMWPEI die beste Biokompatibilität aufweist. Die Transfektionseffizienz der drei verschiedenen Vektoren wurde in vitro an einer Lungenepithelzelllinie und in vivo in Mäuselungen nach intratrachealer Instillation untersucht. Dabei wurde für LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI in vitro die geringste Genexpression detektiert, während die Transfektionsrate in der Mäuselunge für das LMWPEI am höchsten war. Interessanterweise beobachteten wir für PEGPEI ein genau gegensätzliches Verhalten und die sehr hohe Genexpression in der Zellkultur konnte in den Tierversuchen nicht reproduziert werden. Auf Grund dieser Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass eine gute Stabilität der Polyplexe im Mucus, im Surfactant und im Zellplasma, die Transfektion in vivo verändern könnten. Um dies zu untersuchen, wurden die Polyplexe mit Lavagen von Mäuselungen und mit natürlichem Surfactant inkubiert. Es konnte eine abnehmende Stabilität der Polyplexe in der Reihenfolge: PEGPEI > BPEI > LMWPEI beobachtetet werden. Daraus schlussfolgerten wir, dass starke Wechselwirkungen zwischen dem Polymer und der DNA in vivo zu einer schlechteren Freigabe der DNA führt und somit die Transfektionseffizienz verringert. Die Ergebnisse der Studie in Kapitel 3 zeigten, dass mittels LMWPEI im Tiermodel ein biokompatibler und effizienter Genvektor für die Lungentherapie entwickelt werden konnte.
Diese viel versprechenden Ergebnisse gaben Anlass zu weiterführenden Studien über die Verträglichkeit von LMWPEI in der Mäuselunge (Kapitel 4). Dazu wurden die Polyplexe von LMWPEI im Vergleich zu BPEI und PEGPEI via Instillation in die Mäuselunge verabreicht und nach 48 Stunden wurden die Lungen lavagiert. Diese Lavagen wurden dann hinsichtlich Entzündungsfaktoren wie Gesamtzellzahl, Anzahl der Neutrophilen und der Makrophagen, Konzentration der Gesamtproteine und der Zytokine untersucht. Dabei wurden sowohl für die pDNA als auch die Polyplexe erhöhte Werte gemessen, diese konnten eingestuft werden in leichte Entzündungen bei der DNA und LMWPEI/DNA, mittlere Lungenentzündung bei BPEI/DNA und starke Lungenentzündung bei PEGPEI/DNA. Die Betrachtung dieser Ergebnisse im Zusammenhang mit den Transfektionsraten führte uns zu der Schlussfolgerung, dass mit zunehmender Toxizität in der Mäuselunge (LMWPEI < BPEI < PEGPEI) die Transfektionseffizienz (LMWPEI > BPEI > PEGPEI) abnimmt. Folglich wählten wir das LMWPEI für weitergehende Versuche zur Aerosolapplikation in die Lunge aus. Dafür entwickelten wir ein neues Inhalationssystem für Mäuse. Bedauerlicherweise nahmen die Transfektionsraten von LMWPEI/DNA nach der Vernebelung im Vergleich zur Instillation um den Faktor 50 ab. Um den Grund für diese drastische Abnahme zu erkunden, stellten wir Polyplexe her, bei denen sowohl die pDNA als auch das LMWPEI fluoreszenzmarkiert waren und verglichen deren Lungenverteilung nach Instillation mit der nach Inhalation. In den Konfocale Fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der Lungenschnitte zeigte sich, dass die vernebelten Polyplexe gleichmäßig in der Lunge verteilt waren, jedoch in sehr geringen Mengen. Im Gegensatz dazu waren die Polyplexe nach der Instillation in sehr hohen Konzentrationen sowohl in den Bronchien als auch in den Alveolen vorhanden, jedoch wurden nicht alle Abschnitte der Lunge erreicht. Des Weiteren beobachteten wir erstmalig, dass LMWPEI/DNA auch in die Lungenendothelzellen aufgenommen wurde. Zusammenfassend ergibt sich, dass LMWPEI ein sehr effizienter sowie biokompatibler Genvektor für die Lungentherapie ist, und diesbezüglich auch viel bessere Eigenschaften als das häufig eingesetzte BPEI aufweist.
In einer weiteren Studie (Kapitel 5) ist die Entwicklung eines neuen Genvektors beschrieben, der mit einem TAT-Peptid (eine Proteintransduktionsdomaine) modifiziert wurde. Dazu wurde das TAT Peptid an BPEI über eine PEG-Kette kovalent gebunden. Dieses neue PEI Konjugat wurde, wie schon die zuvor beschriebenen Vektoren, hinsichtlich Kondensation der pDNA, Schutz der pDNA im extra- und intrazellulärem Lungenmilieu, Polyplexgröße, Stabilität, Zeta-Potential, in vitro und in vivo Transfektionseffizienz sowie Toxizität und Verteilung der Polyplexe in der Mäuselunge untersucht. Unser Ziel war es gewesen, einen nicht toxischen und sehr effizienten Genvektor zu entwickeln. Dies konnte mit dem neuem TAT-PEG-PEI weitgehend erreicht werden. Dieses Konjugat war in der Lage, sehr kleine und stabile Partikel mit pDNA zu formen. In der Mäuselunge wurde für die TAT-PEG-PEI Polyplexe ein Anstieg der Genexpression von ~600 % im Vergleich zu BPEI und ~300 % im Vergleich zu LMWPEI beobachtet. Weiterhin konnten wir eine hervorragende Verträglichkeit in vivo feststellen, und die Werte der Indikatoren eine Entzündungsrektion lagen im Bereich derer von pDNA. Ein weiterer Vorteil von TAT-PEG-PEI war der sichere Transport der pDNA in die verschiedenen Zellentypen der Lunge. Aus diesem Grund könnte dieser neu Genvektor für die Behandlung verschiedener Lungenerkrankungen eingesetzt werden, bei der verschiedenste Zelltypen betroffen sind, wie z.B. beim Lungenkrebs.
Das wichtigste Ergebnis dieser vier beschriebenen Studien ist, dass TAT-PEG-PEI undim geringerem Maße auch LMWPEI als gut verträgliche und effiziente Vektoren das Potential besitzen, in der Gentherapie verschiedener Lungenerkrankungen Anwendung zu finden. Selbstverständlich sind weitergehende Studien notwendig, um die zwar geringe aber doch vorhandene Toxizität der Polyplexe weiter zu reduzieren. Dieses Ziel könnte beispielsweise erreicht werden, indem man für die Synthese von TAT-PEG-PEI das LMWPEI oder ein hochsubstituiertes PEGPEI verwendet. Des Weiteren sollte die Aufnahme von TAT-PEG-PEI Polyplexen in die Zelle genauer untersucht werden, da bisher widersprüchliche Studien über die Aufnahme und den Weg des TAT Peptides in der Zelle existieren. Weitergehende Studien hinsichtlich zellspezifischer Genvektoren sollten durchgeführt werden. Es wäre z.B. möglich, das LMWPEI mit einer zielgerichteten Struktur zu modifizieren, wie z.B. Lectin, Folat, einem Antikörper oder Peptiden wie z.B. das RGD. Der nächste Schritt sollte dann darin bestehen, therapeutische Gene (IL-12, p53, NO oder Prostacyclin Produzenten) mittels der optimierten Vektoren TAT-PEG-PEI und LMWPEI in die Lungenzellen zu transportieren. Des Weitern sollte versucht werden, das Vernebelungssystem für die in vivo Versuche zu verbessern, z.B. durch einen so genannten Trocknenden Spacer, wie er kürzlich von Rudolph et al. (2005) beschrieben wurde.
Die fünfte Studie dieser Arbeit (Kapitel 6) beschreibt lipid-basierte Formulierungen als inhalierbare Drug Delivery Systeme. Der Wirkstoff Iloprost ist zugelassen in der Aerosoltherapie der Arteriellen Pulmonalen Hypertonie. Jedoch ist die Wirksamkeit dieses Stoffes begrenzt durch seine kurze Halbwertszeit. Infolgedessen war das Ziel der Studie die Entwicklung einer Formulierung, die Iloprost über einen verlängerten Zeitraum freisetzt. Solch eine Formulierung sollte beides gewährleisten: eine hohe Wirkstoffverkapselung und Stabilität während der Vernebelung. Dazu wurden verschiedene Lipidkombinationen für die Herstellung von Liposomen untersucht. Zuerst wurde die Modellsubstanz Carboxyfluorescein in Liposomen verkapselt, die aus Dipalmitoyl-phosphatidylcholin (DPPC) und Cholesterol (CH), oder aus DPPC, CH und PEG-dipalmitoyl-phoshatidylethanolamine (DPPE-PEG), bestanden. Die Stabilität dieser Liposomen wurde an drei verschiedenen Verneblern untersucht: Düsen-, Ultraschall- und Mikropumpenvernebler. Diese Systeme wurden hinsichtlich der Menge an produziertem Aerosol, der Aerosoltropfengröße und deren Einfluss auf die Liposomen verglichen. Dabei wurde die Stabilität der Liposomen in Bezug auf Liposomengröße und der Wirkstoffverkapselung, jeweils vor und nach der Vernebelung beurteilt. Es stellte sich heraus, dass die DPPC/CH Liposomen am stabilsten waren, insbesondere nach der Vernebelung mit dem Ultraschall- und dem Mikropumpenverneblern. In einer zweiten Versuchsreihe wurden die Liposomen mit Iloprost beladen. Dabei wurde die höchste Stabilität und Verkapselungseffizienz ebenfalls für die DPPC/CH Liposomen vor allem nach der Mikropumpenverneblung gefunden. Demzufolge schlussfolgerten wir, DPPC/CH Liposomen sind als eine Formulierung mit verlängerter Wirkstofffreigabe in der Behandlung der pulmonalen Hypertonie gut geeignet. Bis dieses Ziel erreicht werden kann, sind jedoch noch viele weiterführende Untersuchungen notwendig, und die hier präsentieren Ergebnisse stellen erst den Grundstein dafür dar. Als nächste Schritte sollten die Aufnahme der Liposomen in Lungenepithelzellen bzw. die Wirkstofffreisetzung untersucht werden, gefolgt von pharmakokinetischen ex vivo Studien. Danach sollte die Wirksamkeit der Iloprost-Liposomen an einem Tiermodel untersucht werden, bei dem, z.B. ausgelöst durch die Haltung in Hypoxie, eine pulmonale Hypertonie besteht.
Die neuen Formulierungen und Technologien, die in dieser Dissertation beschrieben sind, stellen zwar nur einen kleinen, aber dennoch wichtigen Fortschritt in der Entwicklung von neuen Therapieformen für die Behandlung von Lungenerkrankungen dar. Derartige Formulierungen geben Anlass zur Hoffnung eines Tages die Behandlung von schwerkranken Patienten deutlich zu verbessern. |
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| DOI: | 10.17192/z2005.0363 |