In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synth...

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1. Verfasser: Grünewald, Stephan
Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Chemie
Schlagworte:
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topic Heterologe Genexpression
Peptidsynthetasen
Substratselektivität
Adenylierungsdomäne
Substrate selectivity
in vitro compartmentalization-System
Directed evolution
Chemie
Piperazindion <2,5->
Peptide synthetases
In vitro compartmetalization
rationales Design
Diketopiperazine
Gerichtete Evolution
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Peptidsynthetasen
Substratselektivität
Adenylierungsdomäne
Substrate selectivity
in vitro compartmentalization-System
Directed evolution
Chemie
Piperazindion <2,5->
Peptide synthetases
In vitro compartmetalization
rationales Design
Diketopiperazine
Gerichtete Evolution
In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen
Grünewald, Stephan
Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) catalyze the synthesis of a large group of structurally diverse natural products. Primary structure, size and complexity of a peptide product are dictated by the number and organization of iterated modules and domains, which constitute the protein template. Due to their modular organization NRPSs are predestinated for a rational protein design. Changing the protein template allows the generation of novel peptide derivatives, but in the past such manipulations often lead to a radical decrease of the productivity of the artificial systems, which is ascribed to a disturbed communication. This limitation might be overcome by protein evolution of NRPSs, although their enormous sizes raise other challenges. The basis for the construction of model systems for the evolution of NRPSs was established in this study. First, a system for in vitro evolution of the substrate selectivity of adenylation-(A)-domains was arranged. Following a similar study on t-RNA synthetases, an A-domain (from the TycA protein) was constructed in which almost all residues forming the substrate binding pocket were changed to alanine, leading to 15 single and multi-ple mutants. These were investigated in regard to their catalytic efficiency in activating the cognate amino acid L-phenylalanine as well as to their ability of activating mis- and non-cognate substrates. An observed site specificity for 3-nitro-tyrosine was used for the implementation of the in vitro compartmentalization-(IVC)-system. It was shown that all partial steps of the IVC-system were established successfully. Merely the final detection of the enzyme bound 3-nitro-tyrosine failed due to an insufficient specificity of the available antibodies. In the second part of this study, an in vivo method for the evolution of NRPSs was developed. It was based on the construction of different dimodular NRPS systems for the heterologous production of the cyclic dipeptide D-Phe-L-Pro-diketopiperazine (DKP). This dipeptide shows diverse bioactive properties e.g. as biosensor or antibiotic that can be used for the establishment of an in vivo selection system. The generated NRPS systems were determined in the host Escherichia coli and optimized with regard to their efficiency of product formation. By varying endo- and exogenous parameters, the productivity of the heterologous host E. coli for the nonribosomal synthesis of D-Phe-L-Pro-DKP could be increased about 400 % to 38 µM (12 mg/g BDW). This concentration of the dipeptide is sufficient for the generation of an in vivo selection system based on the antibiotic effect of DKP.
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author Grünewald, Stephan
publishDate 2005
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institution Chemie
title_alt In vitro and in vivo investigations on the evolution of nonribosomal peptide synthetases
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genre Chemistry and allied sciences
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language German
building Fachbereich Chemie
description Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synthetisierten Peptid-Produktes. Aufgrund der modularen Organisation sind NRPSs für ein rationales Design prädestiniert, da durch Veränderung der Proteintemplate völlig neuartige Naturstoffderivate generiert werden können. In der Vergangenheit führten derartige Manipulationen zu erheblichen Einbußen in der Produktivität der konstruierten, artifiziellen Systeme, was auf eine gestörte Kommunikation zurückgeführt wurde. Diese Limitationen ließen sich durch den Einsatz evolutiver Verfahren überwinden, wobei jedoch der Aufbau solcher Systeme aufgrund der enormen Größe von NRPSs nicht ohne weiteres möglich ist. In der vorliegenden Arbeit sollten die Grundlagen für den Aufbau von Modellsystemen für die Evolution von NRPSs geschaffen werden. Zum einen wurde ein System für die in vitro-Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen aufgebaut. In Anlehnung an vergleichbare Arbeiten an tRNA-Synthetasen wurde hierzu zunächst – ausgehend von TycA – eine A-Domäne geschaffen, in der nahezu alle Konstituenten der Substratbindungstasche zu Alanin mutiert wurden. Auf dem Weg hierhin wurden insgesamt 15 Einzel- und Mehrfachmutanten generiert, die hinsichtlich ihrer katalytischen Effizienz bei der Aktivierung der kognaten Aminosäure L-Phenylalanin, sowie auf die Aktivierung mis- und non-kognater Substrate untersucht wurden. Zur Implementierung des sogenannten in vitro compartmentalization-(IVC)-Systems wurde nachfolgend die beobachtete Nebenselektivität für 3-Nitro-Tyrosin ausgenutzt. Hierbei konnten alle Teilschritte des IVC-Systems zur Evolution der A-Domänenselektivität erfolgreich etabliert werden. Einzig die finale Detektion des Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyrosins scheiterte aufgrund einer unzureichenden Spezifität der kommerziell verfügbaren Antikörper. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine in vivo-Methode für die Evolution von NRPSs entwickelt. Ausgangspunkt bildete die Konstruktion verschiedener, dimodularer NRPS-Systeme für die heterologe Produktion des zyklischen Dipeptides D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP). Dieses Dipeptid besitzt verschiedene Bioaktivitäten u. a. als Biosensor und Antibiotikum, die im Hinblick auf die Etablierung von in vivo-Selektionssystemen ausgenutzt werden können. Die konstruierten NRPS-Systeme wurden in E. coli untersucht und nachfolgend hinsichtlich ihrer Effizienz optimiert. Durch Variation endo- und exogener Parameter konnte hierbei die Produktivität des heterologen Wirtes E. coli für die nichtribosomale Synthese von D-Phe-L-Pro-DKP um 400 % auf 38 µM (12 mg/g BDW) gesteigert werden. Dieser Produkttiter liegt in einem Bereich, der das generierte NRPS-System für den Aufbau eines auf der antibiotischen Wirkung von DKP basierten in vivo-Selektionssystems qualifiziert.
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publisher Philipps-Universität Marburg
contents Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) catalyze the synthesis of a large group of structurally diverse natural products. Primary structure, size and complexity of a peptide product are dictated by the number and organization of iterated modules and domains, which constitute the protein template. Due to their modular organization NRPSs are predestinated for a rational protein design. Changing the protein template allows the generation of novel peptide derivatives, but in the past such manipulations often lead to a radical decrease of the productivity of the artificial systems, which is ascribed to a disturbed communication. This limitation might be overcome by protein evolution of NRPSs, although their enormous sizes raise other challenges. The basis for the construction of model systems for the evolution of NRPSs was established in this study. First, a system for in vitro evolution of the substrate selectivity of adenylation-(A)-domains was arranged. Following a similar study on t-RNA synthetases, an A-domain (from the TycA protein) was constructed in which almost all residues forming the substrate binding pocket were changed to alanine, leading to 15 single and multi-ple mutants. These were investigated in regard to their catalytic efficiency in activating the cognate amino acid L-phenylalanine as well as to their ability of activating mis- and non-cognate substrates. An observed site specificity for 3-nitro-tyrosine was used for the implementation of the in vitro compartmentalization-(IVC)-system. It was shown that all partial steps of the IVC-system were established successfully. Merely the final detection of the enzyme bound 3-nitro-tyrosine failed due to an insufficient specificity of the available antibodies. In the second part of this study, an in vivo method for the evolution of NRPSs was developed. It was based on the construction of different dimodular NRPS systems for the heterologous production of the cyclic dipeptide D-Phe-L-Pro-diketopiperazine (DKP). This dipeptide shows diverse bioactive properties e.g. as biosensor or antibiotic that can be used for the establishment of an in vivo selection system. The generated NRPS systems were determined in the host Escherichia coli and optimized with regard to their efficiency of product formation. By varying endo- and exogenous parameters, the productivity of the heterologous host E. coli for the nonribosomal synthesis of D-Phe-L-Pro-DKP could be increased about 400 % to 38 µM (12 mg/g BDW). This concentration of the dipeptide is sufficient for the generation of an in vivo selection system based on the antibiotic effect of DKP.
author2 Marahiel, Mohamed A. (Prof.)
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spelling diss/z2005/0140 2011-08-10 urn:nbn:de:hebis:04-z2005-01409 2005-08-05 In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen opus:1140 2005 In vitro and in vivo investigations on the evolution of nonribosomal peptide synthetases Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synthetisierten Peptid-Produktes. Aufgrund der modularen Organisation sind NRPSs für ein rationales Design prädestiniert, da durch Veränderung der Proteintemplate völlig neuartige Naturstoffderivate generiert werden können. In der Vergangenheit führten derartige Manipulationen zu erheblichen Einbußen in der Produktivität der konstruierten, artifiziellen Systeme, was auf eine gestörte Kommunikation zurückgeführt wurde. Diese Limitationen ließen sich durch den Einsatz evolutiver Verfahren überwinden, wobei jedoch der Aufbau solcher Systeme aufgrund der enormen Größe von NRPSs nicht ohne weiteres möglich ist. In der vorliegenden Arbeit sollten die Grundlagen für den Aufbau von Modellsystemen für die Evolution von NRPSs geschaffen werden. Zum einen wurde ein System für die in vitro-Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen aufgebaut. In Anlehnung an vergleichbare Arbeiten an tRNA-Synthetasen wurde hierzu zunächst – ausgehend von TycA – eine A-Domäne geschaffen, in der nahezu alle Konstituenten der Substratbindungstasche zu Alanin mutiert wurden. Auf dem Weg hierhin wurden insgesamt 15 Einzel- und Mehrfachmutanten generiert, die hinsichtlich ihrer katalytischen Effizienz bei der Aktivierung der kognaten Aminosäure L-Phenylalanin, sowie auf die Aktivierung mis- und non-kognater Substrate untersucht wurden. Zur Implementierung des sogenannten in vitro compartmentalization-(IVC)-Systems wurde nachfolgend die beobachtete Nebenselektivität für 3-Nitro-Tyrosin ausgenutzt. Hierbei konnten alle Teilschritte des IVC-Systems zur Evolution der A-Domänenselektivität erfolgreich etabliert werden. Einzig die finale Detektion des Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyrosins scheiterte aufgrund einer unzureichenden Spezifität der kommerziell verfügbaren Antikörper. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine in vivo-Methode für die Evolution von NRPSs entwickelt. Ausgangspunkt bildete die Konstruktion verschiedener, dimodularer NRPS-Systeme für die heterologe Produktion des zyklischen Dipeptides D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP). Dieses Dipeptid besitzt verschiedene Bioaktivitäten u. a. als Biosensor und Antibiotikum, die im Hinblick auf die Etablierung von in vivo-Selektionssystemen ausgenutzt werden können. Die konstruierten NRPS-Systeme wurden in E. coli untersucht und nachfolgend hinsichtlich ihrer Effizienz optimiert. Durch Variation endo- und exogener Parameter konnte hierbei die Produktivität des heterologen Wirtes E. coli für die nichtribosomale Synthese von D-Phe-L-Pro-DKP um 400 % auf 38 µM (12 mg/g BDW) gesteigert werden. Dieser Produkttiter liegt in einem Bereich, der das generierte NRPS-System für den Aufbau eines auf der antibiotischen Wirkung von DKP basierten in vivo-Selektionssystems qualifiziert. 2005-09-15 Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) catalyze the synthesis of a large group of structurally diverse natural products. Primary structure, size and complexity of a peptide product are dictated by the number and organization of iterated modules and domains, which constitute the protein template. Due to their modular organization NRPSs are predestinated for a rational protein design. Changing the protein template allows the generation of novel peptide derivatives, but in the past such manipulations often lead to a radical decrease of the productivity of the artificial systems, which is ascribed to a disturbed communication. This limitation might be overcome by protein evolution of NRPSs, although their enormous sizes raise other challenges. The basis for the construction of model systems for the evolution of NRPSs was established in this study. First, a system for in vitro evolution of the substrate selectivity of adenylation-(A)-domains was arranged. Following a similar study on t-RNA synthetases, an A-domain (from the TycA protein) was constructed in which almost all residues forming the substrate binding pocket were changed to alanine, leading to 15 single and multi-ple mutants. These were investigated in regard to their catalytic efficiency in activating the cognate amino acid L-phenylalanine as well as to their ability of activating mis- and non-cognate substrates. An observed site specificity for 3-nitro-tyrosine was used for the implementation of the in vitro compartmentalization-(IVC)-system. It was shown that all partial steps of the IVC-system were established successfully. Merely the final detection of the enzyme bound 3-nitro-tyrosine failed due to an insufficient specificity of the available antibodies. In the second part of this study, an in vivo method for the evolution of NRPSs was developed. It was based on the construction of different dimodular NRPS systems for the heterologous production of the cyclic dipeptide D-Phe-L-Pro-diketopiperazine (DKP). This dipeptide shows diverse bioactive properties e.g. as biosensor or antibiotic that can be used for the establishment of an in vivo selection system. The generated NRPS systems were determined in the host Escherichia coli and optimized with regard to their efficiency of product formation. By varying endo- and exogenous parameters, the productivity of the heterologous host E. coli for the nonribosomal synthesis of D-Phe-L-Pro-DKP could be increased about 400 % to 38 µM (12 mg/g BDW). This concentration of the dipeptide is sufficient for the generation of an in vivo selection system based on the antibiotic effect of DKP. Grünewald, Stephan Grünewald Stephan Philipps-Universität Marburg ths Prof. Marahiel Mohamed A. Marahiel, Mohamed A. (Prof.)
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