In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur Evolution nichtribosomaler Peptidsynthetasen

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synth...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
1. Verfasser: Grünewald, Stephan
Beteiligte: Marahiel, Mohamed A. (Prof.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Zusammenfassung:Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synthetisierten Peptid-Produktes. Aufgrund der modularen Organisation sind NRPSs für ein rationales Design prädestiniert, da durch Veränderung der Proteintemplate völlig neuartige Naturstoffderivate generiert werden können. In der Vergangenheit führten derartige Manipulationen zu erheblichen Einbußen in der Produktivität der konstruierten, artifiziellen Systeme, was auf eine gestörte Kommunikation zurückgeführt wurde. Diese Limitationen ließen sich durch den Einsatz evolutiver Verfahren überwinden, wobei jedoch der Aufbau solcher Systeme aufgrund der enormen Größe von NRPSs nicht ohne weiteres möglich ist. In der vorliegenden Arbeit sollten die Grundlagen für den Aufbau von Modellsystemen für die Evolution von NRPSs geschaffen werden. Zum einen wurde ein System für die in vitro-Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen aufgebaut. In Anlehnung an vergleichbare Arbeiten an tRNA-Synthetasen wurde hierzu zunächst – ausgehend von TycA – eine A-Domäne geschaffen, in der nahezu alle Konstituenten der Substratbindungstasche zu Alanin mutiert wurden. Auf dem Weg hierhin wurden insgesamt 15 Einzel- und Mehrfachmutanten generiert, die hinsichtlich ihrer katalytischen Effizienz bei der Aktivierung der kognaten Aminosäure L-Phenylalanin, sowie auf die Aktivierung mis- und non-kognater Substrate untersucht wurden. Zur Implementierung des sogenannten in vitro compartmentalization-(IVC)-Systems wurde nachfolgend die beobachtete Nebenselektivität für 3-Nitro-Tyrosin ausgenutzt. Hierbei konnten alle Teilschritte des IVC-Systems zur Evolution der A-Domänenselektivität erfolgreich etabliert werden. Einzig die finale Detektion des Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyrosins scheiterte aufgrund einer unzureichenden Spezifität der kommerziell verfügbaren Antikörper. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine in vivo-Methode für die Evolution von NRPSs entwickelt. Ausgangspunkt bildete die Konstruktion verschiedener, dimodularer NRPS-Systeme für die heterologe Produktion des zyklischen Dipeptides D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP). Dieses Dipeptid besitzt verschiedene Bioaktivitäten u. a. als Biosensor und Antibiotikum, die im Hinblick auf die Etablierung von in vivo-Selektionssystemen ausgenutzt werden können. Die konstruierten NRPS-Systeme wurden in E. coli untersucht und nachfolgend hinsichtlich ihrer Effizienz optimiert. Durch Variation endo- und exogener Parameter konnte hierbei die Produktivität des heterologen Wirtes E. coli für die nichtribosomale Synthese von D-Phe-L-Pro-DKP um 400 % auf 38 µM (12 mg/g BDW) gesteigert werden. Dieser Produkttiter liegt in einem Bereich, der das generierte NRPS-System für den Aufbau eines auf der antibiotischen Wirkung von DKP basierten in vivo-Selektionssystems qualifiziert.