Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A

Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-D...

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1. Verfasser: Schracke, Nadine
Beteiligte: Bölker, Michael (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2005
Biologie
Schlagworte:
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publisher Philipps-Universität Marburg
topic Nnonribosomal peptide synthetase
Peptidsynthetasen
Nichtribosomale Peptidsynthetase
Aldoreductase
Oxidoreductasen
Reductasen
Biochemie
Reductase domain
Biowissenschaften, Biologie
Gramicidin A
Gramicidin A
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Peptidsynthetasen
Nichtribosomale Peptidsynthetase
Aldoreductase
Oxidoreductasen
Reductasen
Biochemie
Reductase domain
Biowissenschaften, Biologie
Gramicidin A
Gramicidin A
Schracke, Nadine
Gramicidin is a polypeptide which consists fo 15 hydrophobic amino acids with alternating L-D-configuration. It forms homodimers in vivo that function as ion channels in lipid bilayers. The primary strucutre of Gramicidin A has been determined as formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-ethanolamine. The peptide is protected from degradation by N-formylation of the N-terminus and ethanolamine at the C-terminus. In the work presented here a gene cluster of 61 kb was identified with the help of a fosmid gene bank from Bacillus brevis ATCC 8185. Sequencing revealed the Gramicidin A nonribosomal peptide synthetase. A multienzyme complex consisting of the four NRPSs LgrABCD which encode 2, 4, 6 and 4 modules, respectively, was determined to be responsible for assembly and modification of the pentadecapeptide. In silico investigations of the substrate specificity of all 16 modules were confirmed by biochemical analyses of the first three adenylation domains. By this, the principle of colinearity of this NRPS was proven. The putative C-terminal Reductase (R) domain which is fused to module 16 was thought to set the N-formylated peptide chain free as alcohol. Biochemical investigations using the recombinant R-Domain with a peptidyl-substrate variant showed that the enzyme conducts only a single-step reduction using NAD(P)H to the aldehyde intermediate. By using different substrats, a broad substrate tolerance of the R domain was demonstrated. The search for a second reductase which supposedly converts the peptidyl-aldehyde to the final product peptidyl-ethanolamine led to the discovery of the aldoreductase LgrE. In coupled assays using both reductases peptidyl-ethanolamine was produced. In in vitro investigations of LgrE with purified, enzymatically produced aldehyde-intermediate, a strict NADPH-dependence of the enzyme was shown. The aldoreductase showed a more stringent substrate specificity than the R domain. The second part of this work showed the development of a method for module exchanges in NRPSs at the genetic level. At first a gene fragment coupled to a selectable marker is introduced into the genome via homologous recombination. In a second step the marker is lost again via loop out using direct repeats. The gene fragment remains in the chromosome, and the new NRPS product can be investigated.
Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A
author2 Bölker, Michael (Prof. Dr.)
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title_alt The molecular logic of nonribosomal peptide synthetases: identification and biochemical characterization of the biosynthesis genes for Gramicidin A
institution Biologie
author Schracke, Nadine
building Fachbereich Biologie
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publishDate 2005
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description Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-Ethanolamin. Das Peptid ist am N Terminus durch N Formylierung und am C Terminus durch Ethanolamin vor Abbau geschützt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Genkluster von 61 kb aus B. brevis ATCC 8185 mit Hilfe einer Fosmid-Genbank identifiziert und vollständig sequenziert, der für die Gramicidin A - nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) kodiert. Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden. Die putative C-terminale Reduktase (R) Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt. Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden.
contents Gramicidin is a polypeptide which consists fo 15 hydrophobic amino acids with alternating L-D-configuration. It forms homodimers in vivo that function as ion channels in lipid bilayers. The primary strucutre of Gramicidin A has been determined as formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-ethanolamine. The peptide is protected from degradation by N-formylation of the N-terminus and ethanolamine at the C-terminus. In the work presented here a gene cluster of 61 kb was identified with the help of a fosmid gene bank from Bacillus brevis ATCC 8185. Sequencing revealed the Gramicidin A nonribosomal peptide synthetase. A multienzyme complex consisting of the four NRPSs LgrABCD which encode 2, 4, 6 and 4 modules, respectively, was determined to be responsible for assembly and modification of the pentadecapeptide. In silico investigations of the substrate specificity of all 16 modules were confirmed by biochemical analyses of the first three adenylation domains. By this, the principle of colinearity of this NRPS was proven. The putative C-terminal Reductase (R) domain which is fused to module 16 was thought to set the N-formylated peptide chain free as alcohol. Biochemical investigations using the recombinant R-Domain with a peptidyl-substrate variant showed that the enzyme conducts only a single-step reduction using NAD(P)H to the aldehyde intermediate. By using different substrats, a broad substrate tolerance of the R domain was demonstrated. The search for a second reductase which supposedly converts the peptidyl-aldehyde to the final product peptidyl-ethanolamine led to the discovery of the aldoreductase LgrE. In coupled assays using both reductases peptidyl-ethanolamine was produced. In in vitro investigations of LgrE with purified, enzymatically produced aldehyde-intermediate, a strict NADPH-dependence of the enzyme was shown. The aldoreductase showed a more stringent substrate specificity than the R domain. The second part of this work showed the development of a method for module exchanges in NRPSs at the genetic level. At first a gene fragment coupled to a selectable marker is introduced into the genome via homologous recombination. In a second step the marker is lost again via loop out using direct repeats. The gene fragment remains in the chromosome, and the new NRPS product can be investigated.
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Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden. Die putative C-terminale Reduktase (R) Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt. Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden. Gramicidin is a polypeptide which consists fo 15 hydrophobic amino acids with alternating L-D-configuration. It forms homodimers in vivo that function as ion channels in lipid bilayers. The primary strucutre of Gramicidin A has been determined as formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-ethanolamine. The peptide is protected from degradation by N-formylation of the N-terminus and ethanolamine at the C-terminus. In the work presented here a gene cluster of 61 kb was identified with the help of a fosmid gene bank from Bacillus brevis ATCC 8185. Sequencing revealed the Gramicidin A nonribosomal peptide synthetase. A multienzyme complex consisting of the four NRPSs LgrABCD which encode 2, 4, 6 and 4 modules, respectively, was determined to be responsible for assembly and modification of the pentadecapeptide. In silico investigations of the substrate specificity of all 16 modules were confirmed by biochemical analyses of the first three adenylation domains. By this, the principle of colinearity of this NRPS was proven. The putative C-terminal Reductase (R) domain which is fused to module 16 was thought to set the N-formylated peptide chain free as alcohol. Biochemical investigations using the recombinant R-Domain with a peptidyl-substrate variant showed that the enzyme conducts only a single-step reduction using NAD(P)H to the aldehyde intermediate. By using different substrats, a broad substrate tolerance of the R domain was demonstrated. The search for a second reductase which supposedly converts the peptidyl-aldehyde to the final product peptidyl-ethanolamine led to the discovery of the aldoreductase LgrE. In coupled assays using both reductases peptidyl-ethanolamine was produced. In in vitro investigations of LgrE with purified, enzymatically produced aldehyde-intermediate, a strict NADPH-dependence of the enzyme was shown. The aldoreductase showed a more stringent substrate specificity than the R domain. The second part of this work showed the development of a method for module exchanges in NRPSs at the genetic level. At first a gene fragment coupled to a selectable marker is introduced into the genome via homologous recombination. In a second step the marker is lost again via loop out using direct repeats. The gene fragment remains in the chromosome, and the new NRPS product can be investigated. Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A 2011-08-10 2005-06-09 2005-04-18 opus:1026 Philipps-Universität Marburg ths Prof. Dr. Bölker Michael Bölker, Michael (Prof. Dr.) Schracke, Nadine Schracke Nadine
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