Identifizierung während der Apoptose transkriptionell hochregulierter Gene mittels einer viralen Genfalle und Charakterisierung eines dieser Gene: Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase Ibeta

Zusammenfassung Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanism...

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Main Author: Schneider, Stephanie
Contributors: Bölker, Michael (Prof. Dr.) (Thesis advisor)
Format: Dissertation
Language:German
Published: Philipps-Universität Marburg 2005
Biologie
Subjects:
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Description
Summary:Zusammenfassung Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist sowohl für die Erklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen als auch für zukünftige rationale Therapieansätze von Bedeutung. Besonders bei der Entwicklung neuer pharmakologischer Substanzen, die gegen Krebs oder neurodegenerative Krankheiten eingesetzt werden können, ist die Entdeckung neuer apoptoserelevanter Gene von ausschlaggebender Relevanz. Das Ziel dieser Arbeit war daher, neue Gene zu finden, deren Expression während der Apoptose induziert wird, und eines dieser Gene funktionell zu charakterisieren. Als Studiensystem wurden IL-3-abhängige Zellen (FDC P1) benutzt, da die Existenz eines schnell aktivierbaren Apoptose-Signalwegs in verschiedensten Zellen zu dem Schluss geführt hatte, dass Überlebensfaktoren diesen Signalweg reprimieren. IL-3 abhängige Zelllinien hören nicht auf zu proliferieren, wenn ihnen IL-3 entzogen wird, vielmehr durchlaufen sie Apoptose. IL-3 sichert also das Überleben der Zellen dadurch, dass apoptoseaktivierende Signal-Kaskaden reprimiert werden. Um neue Komponenten solcher regulatorischer Kaskaden ausfindig zu machen, war es nötig eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Zellen trotz eines Apoptosestimulus am Leben zu erhalten. Eine entsprechende Strategie zur Identifizierung eben solcher Gene, die schon erfolgreich bei eine Reihe anderer Fragestellungen eingesetzt worden war, beruht auf dem Einsatz von Genfallen. Aus der Kombination von Genfalleninsertion und dem Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte letztendlich eine Methode entwickelt werden, die die Apoptoseinduktion durch IL-3 Entzug einer strikt IL-3 abhängigen Zelllinie erlaubte. Dabei wird, nach gezielter Rekombination, das Gen für den Überlebensfaktor IL-3 exprimiert. Dadurch werden die Zellen unabhängig von exogen zugeführtem Cytokin. Anders als konventionelle Genfallen-Strategien sollte der Cre/loxP-Ansatz nicht nur eine Anreicherung von Genen erlauben, die durch spezifische biologische Stimuli induziert werden, sondern auch die Identifizierung von nur transient exprimierten Genen ermöglichen. Mit Hilfe eines solchen Ansatzes konnte aus der FDC P1-Zelllinie das Gen Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase isoliert werden. Zur Validierung der transkriptionellen Induktion der identifizierten Gene wurden Northern-Blot Experimente durchgeführt, die zeigten, dass die Transkriptmenge nur in einem eng begrenzten Zeitfenster ansteigt und danach wieder auf das Ausgangsniveau absinkt. Somit erfüllt das gewählte Genfallensystem auch die Forderung nach der Detektion von nur vorübergehend transkriptionell aktivierten Genen. Die Ergebnisse aus den Proliferationsexperimenten mit FDC P1-Zellen zeigten, dass PIP5K in den Zellzyklus eingreift. PIP5K überexperimierende Zellen haben neben einer erhöhten Proliferationsrate (ca. 3-fach höhere Zellzahlen) auch eine verringerte Spontanapoptose (ca. 70% weniger apoptotische Zellen). In Weichagarexperimenten konnte auch eine erhöhte Stressresistenz der Zellen beobachtet werden (ca. 8-fach unter normalen Il-3 Bedingungen). Nachdem in FDC P1-Zellen nur eine moderate Expression von exogener PIP5K erzielt werden konnte, wurden stabile PIP5K-überexprimierende HeLa-Zellpopulationen isoliert. In einer systematischen, biochemischen Analyse von Zellzyklusregulatoren wurden darüber hinaus PIP5K regulierte Zellzyklusproteine identifiziert. So führte die PIP5K Überexpression zu einer Induktion von PCNA, hsMAD2 und DNA-Polymerase , und zu einer Repression von p21/Cip1/Waf1. Schließlich wurde die Rolle von PIP5K während der, durch alternative Stimuli induzierten Apoptose in HeLa-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass PIP5K die zytostatika- und strahleninduzierte Apoptose akzeleriert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass PIP5K den Apoptoseprozess, je nach Stimulus, sowohl verzögern als auch beschleunigen kann. Während PIP5K bei IL-3 Entzug anti-apoptotisch wirkt, geschieht genau das Gegenteil nach zytostatischer Behandlung. Insgesamt spiegelt dies eine subtil aufeinander abgestimmte Regulation von Zellzyklus und Apoptose wieder.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0081