Funktionelle Untersuchungen der Protein-Histidin-Phosphatase und Identifizierung der ß-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins als deren Substrat

Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte die erste im Säugetier entdeckte Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) weiter charakterisiert und ihre physiologische Funktion in der Zelle näher untersucht werden. Aus diesem Grund wurde versucht, ein geeignetes Modellsystem zu entwickeln, mit dessen Hilfe...

Ausführliche Beschreibung

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser: Mäurer, Anette
Beteiligte: Klumpp, Susanne (Prof. Dr.) (BetreuerIn (Doktorarbeit))
Format: Dissertation
Sprache:Deutsch
Veröffentlicht: Philipps-Universität Marburg 2004
Pharmazeutische Chemie
Schlagworte:
Online Zugang:PDF-Volltext
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Beschreibung
Zusammenfassung:Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte die erste im Säugetier entdeckte Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) weiter charakterisiert und ihre physiologische Funktion in der Zelle näher untersucht werden. Aus diesem Grund wurde versucht, ein geeignetes Modellsystem zu entwickeln, mit dessen Hilfe man die Expressionsrate des Enzyms zuverlässig verändern konnte, um funktionelle Untersuchungen durchführen zu können. Des Weiteren wurde nach einem neuen Substrat der PHP gesucht, mit dessen Hilfe man ebenfalls Rückschlüsse auf die Funktion des Enzyms ziehen konnte. Zuerst wurde die Expression der PHP in embryonalen Neuronen mittels Antisense-technologie herabreguliert. Es zeigte sich, dass die Zugabe der Antisense-Oligonukleotide die Zellen bei einer durch Staurosporin hervorgerufenen, apoptotischen Schädigung vor dem Zelltod bewahrt. Dieser Schutz konnte mit unterschiedlichen Antisense-Oligonukleotiden, die gegen verschiedene Stellen der PHP-Sequenz gerichtet waren, gezeigt werden. Der Effekt war somit spezifisch und es war davon auszugehen, dass die PHP an der Regulation der Apoptose in neuronalen Zellen beteiligt ist. Da es aber nicht möglich war, die schützende Wirkung der Oligonukleotide und eine gleichzeitige Herabregulierung der PHP-Expression auf Proteinebene zu zeigen, gab es keinen direkten Beweis dafür, dass der 20-30%ige Rückgang der Apoptose in den mit Antisense-Oligonukleotiden und Staurosporin behandelten Zellen tatsächlich auf eine geringere PHP-Menge innerhalb der Neurone zurückzuführen war. Auffällig war allerdings, dass, wie Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden zeigten, auch nur 20-30% der Neurone überhaupt mit den Antisense-Oligonukleotiden transformiert werden konnten. Dieser Prozentsatz korrelierte mit dem Rückgang der Schädigung nach Staurosporinzugabe und unterstützte somit die Annahme, dass die PHP an der Regulation des Zelltods beteiligt ist. Um diesem Hinweis weiter nachzugehen, wurde im Folgenden ein rekombinanter Adenovirus hergestellt, in dessen Genom man die genetische Information der PHP integrierte. Zellen, die mit diesem Virus (Ad5-PHP) infiziert wurden, waren anschließend in der Lage die PHP stabil überzuexprimieren. Dies gelang auch in SH-SY5Y-Zellen, die neuronalen Ursprungs sind. Infizierte man diese Zellen mit dem Virus, so konnte man schon nach 24 h bei einem Teil von ihnen Veränderungen der Zellmorphologie feststellen. Sie wurden klein und kugelig und schienen die aus der Infektion resultierende Überexpression der PHP, nicht zu vertragen. Untersuchungen auf Apoptose zeigten, dass von den mit Ad5-PHP infizierten Zellen nach 3 Tagen signifikant mehr geschädigt waren, als das bei Vergleichskulturen, die zur Kontrolle mit einem Adenovirus, dem das PHP-Gen nicht einkloniert worden war, der Fall gewesen war. Der Tod der Zellen war also nicht auf die Virusinfektion als solche, sondern auf die Überexpression der PHP, die man mittels Westernblot auch während des gesamten Versuchs zeigen konnte, zurückzuführen. Somit war es das erste Mal möglich gewesen, eine Funktion der PHP aufzudecken: Bei Überexpression des Enzyms sterben neuronale Zellen apoptotisch ab. Die PHP ist in diesen Zellen an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die beta-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins ein neues, physiologisch relevantes Substrat der PHP ist. G-beta wird durch die Nukleosid-Diphosphat-Kinase B (NDPK B) an Histidin266 phosphoryliert und durch die PHP dephosphoryliert. Diese Dephosphorylierung ist spezifisch für die PHP. Mit der alkalischen Phosphatase konnte sie nicht beobachtet werden. Für eine physiologische Relevanz der Dephosphorylierungsreaktion spricht zudem, dass G-beta und die PHP in den Geweben unterschiedlicher Organe wie Herz, Hirn oder Lunge und auch in den verschiedenen Gehirnregionen wie Kortex, Striatum, Cerebellum und Hippokampus kolokalisiert sind.
DOI:https://doi.org/10.17192/z2005.0002